rTMS對腦梗死大鼠記憶功能及海馬IL-1的影響研究

張靖慧，方瑩瑩，李娜

重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)是一種新型的無痛無創(chuàng)腦刺激技術(shù)，臨床研究發(fā)現(xiàn)磁刺激可改善正常受試者及腦卒中患者學(xué)習(xí)記憶功能[1]，提高恢復(fù)期腦卒中患者的運動學(xué)習(xí)技能，但其機制尚不明確。近年來大量研究表明白細胞介素1(interleukin-1，IL-1)在低濃度條件下具有一定腦保護作用，參與海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶過程[2]，長時程增強(long-term potentiation，LTP)刺激可促進海馬內(nèi)IL-1β表達[3]。本研究應(yīng)用腦梗死大鼠模型，觀察rTMS對腦梗死后空間記憶功能以及海馬區(qū)IL-1β mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實驗動物：健康成年雄性SPF級SD大鼠45只，體質(zhì)量220.2g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。②試劑：Trizol：15596-018，Invitrogen；cDNA第一鏈合成試劑盒：#K1622，F(xiàn)ermentas；SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2X)：#K0242，F(xiàn)ermentas；Ex TaqTM：DRR100A，TAKARA；DL2000 DNA Marker：D501A，TAKARA；DL15000 DNA Marker：D502A，TAKARA；引物合成：南京金斯瑞。③儀器：磁刺激治療采用YRDCCY-Ⅰ型磁刺激儀(武漢依瑞德醫(yī)療設(shè)備新技術(shù)有限公司生產(chǎn)) ；Morris水迷宮實驗采用水迷宮實驗系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn))；qRT-PCR使用illumina eco Real-Time PCR System測定。

1.2 方法 ①分組：將45只大鼠隨機分為假手術(shù)組、對照組和rTMS組，每組15只。②造模：將對照組和rTMS組大鼠參照改良的Longa線栓法制作右側(cè)大腦中動脈阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型[4-5]，腦缺血后90min將線栓拔出，完成造模。采用Bederson評分法觀察大鼠清醒后行為學(xué)改變[6]。將1、2、3分動物納入本實驗。共29只大鼠制模成功并納入本研究，實驗過程中有3只死亡，最終對照組有12只、rTMS組有14只大鼠完成實驗。假手術(shù)組線栓從頸總動脈分叉處進入頸內(nèi)動脈約5mm，無病理行為學(xué)改變。③rTMS治療：rTMS組大鼠從術(shù)后1d開始給予患側(cè)大腦磁刺激治療，采用YRDCCY-Ⅰ型磁刺激儀。將清醒狀態(tài)下的大鼠固定在自制透明固定器中。8字形線圈(8字中心最大磁場強度1.8T)，隔著固定器(厚0.2mm)緊貼大鼠頭皮，線圈中心位于大鼠梗死側(cè)大腦上方[7]，刺激強度為120% 靜息運動閾值(50%最大磁場強度)，刺激頻率為10Hz，總刺激量為300脈沖，單序列30脈沖，共10個序列，中間間隔50s[8]，每次治療8min。每天1次，連續(xù)5d。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) ①行為學(xué)檢測：采用Morris水迷宮試驗。模型制作的第3天開始，3組大鼠進行水迷宮實驗，共5次，4d內(nèi)完成，第1天訓(xùn)練2次。圓形平臺固定放置于第三象限中心，放入適量水使平臺低于水平面3cm。前4次為訓(xùn)練，每次分別從3個象限(除平臺所在象限)的中點將大鼠逐一面向池壁放入水中，設(shè)定大鼠在平臺上停留3s為找到平臺，記錄大鼠在水中尋找并爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。如果大鼠在60s內(nèi)未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺，停留20s以熟悉環(huán)境，此時逃避潛伏期記為60s。最后一次為檢測，撤去平臺，于第1象限入水點處將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠60s內(nèi)第一次穿過平臺的搜索時間(逃避潛伏期)。將最后一次成績進行統(tǒng)計分析，以此來評價大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。②實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測大鼠海馬IL-1β mRNA表達情況：術(shù)后6d使用ABI StepOne Plus測定。并觀察梗死灶(皮層、紋狀體)IL-1βmRNA表達情況。同時檢測炎癥相關(guān)因子：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)。qRT-PCR內(nèi)參為：肌動蛋白(β-Actin)。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮測試 與假手術(shù)組相比，對照組及rTMS 組大鼠的逃避潛伏期均顯著延長(P<0.01)，而rTMS組較對照組的逃避潛伏期則明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2 qRT-PCR結(jié)果 對照組、rTMS組IL-1β mRNA在患側(cè)海馬及皮層的表達量均較假手術(shù)組增高(P<0.01)，rTMS組在患側(cè)海馬的IL-1β mRNA表達較對照組顯著增高(P<0.01)，在患側(cè)皮層中rTMS組IL-1β mRNA表達較對照組無明顯變化。檢測患側(cè)海馬iNOS、TNFβ mRNA以明確炎癥反應(yīng)水平，結(jié)果提示對照組、rTMS組iNOS、TNFβ mRNA表達量均較假手術(shù)組增高(P<0.01)，rTMS組較對照組有所下降，但無顯著差異。見表2。

表1 rTMS對腦梗死大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響 分，

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05

組別nIL?1βmRNA患側(cè)海馬患側(cè)皮層患側(cè)海馬區(qū)iNOSTNF?α假手術(shù)組151111對照組 121．82±0．48a3．34±0．51a3．15±0．27a1．59±0．18arTMS組146．14±1．05ab4．61±0．93a2．66±0．37a1．46±0．07a

與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05

3 討論

本研究通過Morris水迷宮實驗觀察rTMS對空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長，rTMS組大鼠逃避潛伏期較對照組明顯縮短，說明rTMS一定程度上改善腦梗死大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能。

IL-1是一種經(jīng)典炎性細胞因子，存在α、β兩種異構(gòu)體，主要合成部位是海馬，生理情況下，IL-1及IL-1mRNA在腦內(nèi)含量很低，并且以IL-1β為主。正常生理狀態(tài)下，IL-1β對記憶固化起重要作用，參與海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶過程。生理狀態(tài)下低濃度IL-1β可協(xié)同IL-6，促進神經(jīng)生長因子釋放、新血管形成、膠質(zhì)增生，從而增強神經(jīng)細胞抗缺血能力和促進修復(fù)作用[9]。條件性恐懼實驗或者LTP刺激后大鼠海馬區(qū)IL-1βmRNA表達增加[3,10]，腹腔注射小劑量IL-1β可促進大鼠躲避記憶和條件性恐懼記憶能力[11]。急性腦梗死引起IL-1β濃度病理性增高，成為一種內(nèi)源性致熱源，在炎癥和急性期反應(yīng)中發(fā)揮作用，參與神經(jīng)損傷，促進炎癥反應(yīng)，擴大腦梗死面積。腦梗死后IL-1β表達具有一定時間依賴性，動物研究表明， IL-1β mRNA在腦梗死后6h開始增高，12h～3d達到高峰，隨后逐漸下降至正常水平[12]，本研究中腦梗死后6d梗死灶與患側(cè)海馬區(qū)IL-1βmRNA表達水平仍高于假手術(shù)組，與文獻報道基本一致[12]。本研究于腦梗死急性期(MCAO術(shù)后1d)給予rTMS治療，結(jié)果顯示rTMS促進患側(cè)海馬區(qū)IL-1β mRNA表達增加，對梗死灶I(lǐng)L-1β mRNA表達無明顯改變，提示其具有部位特異性，而且rTMS不影響其它炎癥因子(iNOS、TNF-α)表達，提示rTMS對炎癥反應(yīng)無增強作用。其具體機制尚不明確，但初步提示了海馬區(qū)IL-1β濃度改變在腦梗死后學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)過程中可能起到重要作用。此外rTMS為脈沖樣刺激模式，一般認為其作用機制與突觸可塑性相關(guān)。rTMS對神經(jīng)的調(diào)控作用有明顯的頻率依賴性，高頻(>1Hz)rTMS對神經(jīng)興奮性的調(diào)控表現(xiàn)為類似LTP作用。LTP刺激可促進大鼠海馬區(qū)IL-1βmRNA表達增加[3,10]，根據(jù)本研究結(jié)果推測rTMS可能通過影響海馬區(qū)IL-1β以改善腦梗死后空間記憶功能。

本研究使用的磁刺激線圈刺激面積較大，無法實現(xiàn)精確靶向刺激患側(cè)海馬區(qū)。研究表明空間學(xué)習(xí)記憶功能需要完整的神經(jīng)網(wǎng)路參與，在空間導(dǎo)航過程中，海馬是主要參與部位，而在回憶過程中，除了海馬，還需要海馬旁皮層的參與，海馬旁皮層包括內(nèi)外側(cè)前額葉、楔前葉、后扣帶回、壓后皮層以及內(nèi)外側(cè)顳葉區(qū)[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)皮層下內(nèi)側(cè)隔/斜角帶核的GABA能神經(jīng)元的突觸與海馬神經(jīng)元形成鏈接[14]，從細胞層面上證實了海馬與皮層間存在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果提示患側(cè)大腦在磁刺激后海馬區(qū)IL-1βmRNA表達增高，可能是海馬神經(jīng)元受到磁刺激直接作用的結(jié)果，亦可能是磁刺激促進整個學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的結(jié)果，其具體機制需進一步研究證實。

綜上所述，本研究表明急性期腦梗死行rTMS治療可促進空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)，其作用機制可能與rTMS增加患側(cè)海馬區(qū)IL-1βmRNA表達相關(guān)，為進一步探索rTMS治療腦卒中最佳治療方案提供有力基礎(chǔ)依據(jù)。

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