醫用透明質酸鈉修復貼的生物學試驗

王宗尉　肖佳音　李慶忠

(黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150001)

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醫用透明質酸鈉修復貼的生物學試驗

王宗尉肖佳音李慶忠

(黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，黑龍江 哈爾濱 150001)

摘要目的觀察醫用透明質酸鈉修復貼對實驗動物的皮膚致敏反應、皮膚刺激反應和細胞毒性反應，為其作為醫療器械用途的生物安全性評價提供科學依據。方法根據該產品與人體接觸方式及接觸時間，按照醫療器械生物學評價標準選擇皮膚致敏試驗，皮膚刺激試驗，細胞毒性試驗進行生物安全性評價。結果未出現皮膚致敏反應及皮膚刺激反應，無細胞毒性。結論醫用透明質酸鈉修復貼臨床用于緩解和補償損傷使用是安全的。

關鍵詞醫用透明質酸鈉修復貼；醫療器械；生物安全性評價

文章編碼：1001-8131(2016)02-0142-02

透明質酸鈉是一種天然直鏈大分子多糖，對其深加工后制成的醫用透明質酸鈉凝膠被廣泛用于眼科手術，防治外傷性或退變性骨關節炎，外科手術等。由透明質酸鈉加工制得的醫用透明質酸鈉修復貼作為一種新型生物材料，用于修復皮膚疤痕，臨床對其安全評價未見報道。因此我們對其進行生物安全評價，現報告如下：

1資料與方法

1.1一般資料：①供試品：醫用透明質酸鈉修復貼，哈爾濱市天地仁醫藥科技有限公司，批號20130129，規格為5 cm×5 cm。②儀器設備：CO2培養箱(thermo electron corporation，3111)，倒置顯微鏡(重慶光電儀器總公司，XDS-1B)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，AL204)，家用微波爐(順德惠而浦蜆華微波爐制品有限公司，KS2183)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械三廠，H.H.S)，恒溫培養箱(南京實驗儀器廠，000984-09-0)，電熱鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司，DGG-9240BD)，臺式滅菌器(山東新華醫療器械股份有限公司，TMQ.CV/5070)。

1.2主要試劑：RPMI.1640培養液(吉諾生物醫藥技術有限公司，批號：12081705)，胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號：120509)，青-鏈霉素(gibco by life technologies，批號：1116255)，消化酶(吉諾生物醫藥技術有限公司，批號：12060701)，瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20080802)，中性紅(天津市天新精細化工開發中心，批號：20050428)，PBS(吉諾生物醫藥技術有限公司，批號：12082903)，DPBS(M&C Gene Technology，批號：A0612110)，苯酚(天津市永大化學試劑有限公司，批號：20110326)，吸收性醫用明膠海綿(金陵藥業股份有限公司南京金陵制藥廠，批號：121004)。

1.3實驗動物及細胞：健康、初成年的同一遠交系雄性白化豚鼠15只，體重300～500g，由吉林市昌邑區左家實驗動物養殖場提供，生產許可證：SCXK(吉)2009-0001。健康、初成年的同一品系雄性白化兔3只，體重分別為2.2 kg，2.3 kg和2.5 kg，由哈藥集團中藥二廠提供，生產許可證：SCXK(黑)2012-002。ATCC CCL1[NCTC clone 929(小鼠成纖維細胞)]由中科院提供。

1.4方法：按中華人民共和國國家標準進行試驗[1-3]。

1.4.1 遲發型超敏反應封閉貼敷試驗。①試驗樣品制備：試驗樣品：剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸敷貼片，直接用于試驗。陰性對照：將濾紙剪成2.5 cm×2.5 cm尺寸并用氯化鈉注射液浸透，作為陰性對照樣品敷貼片。②試驗步驟：將15只豚鼠分為兩組，其中試驗樣品組10只豚鼠，陰性對照組5只豚鼠。誘導階段：將試驗樣品和陰性對照分別局部貼敷于豚鼠左上背部除毛部位，再用封閉性包扎帶固定6 h，6 h后除去封閉包扎帶和敷貼片。1周中連續3 d重復該步驟，連續3周。激發階段：最后一次誘導貼敷后14 d，用試驗樣品對試驗樣品組和對照組全部豚鼠進行激發。將試驗樣品貼敷于每只豚鼠的右下腹側去毛部位，6 h后除去固定器、封閉包扎帶和敷貼片。

1.4.2皮膚刺激試驗。①試驗樣品制備：同遲發型超敏反應封閉貼敷試驗。②試驗步驟：選擇體重大于2 kg同一品系健康白化兔3只，于實驗前24 h將家兔背部被毛除去(約10 cm×15 cm區域)，作為試驗和觀察部位。單次接觸試驗：在家兔背部左前側和右后側貼敷試驗樣品，在家兔背部右前側和右后側貼敷陰性對照，用紗布覆蓋敷貼片部位，并用包扎帶固定4 h。多次接觸試驗：單次接觸試驗完成72 h后進行，試驗方法同單次接觸試驗，連續實驗12d。

1.4.3細胞毒性試驗(瓊脂擴散法)。①試驗樣品制備：試驗樣品：將透明質酸鈉修復貼制成直徑約5 mm的圓片；陰性對照：將高密度聚乙烯制成直徑約為5 mm，厚約2 mm的圓片；陽性對照：將醫用明膠海綿制成直徑約為5 mm的圓片，并用20%的苯酚溶液將其浸透。②試驗步驟：選擇復蘇傳至第4代的細胞再傳代后培養48h，消化及稀釋，使細胞濃度為3×105個/mL。取6個培養皿，每皿加10 mL細胞懸液，放入CO2培養箱37℃培養24 h。將制備好的2×瓊脂加熱融化后冷卻到48 ℃，與預熱至48 ℃的2×培養液以1∶1混勻后，倒入上述棄去原培養液的6個培養皿中，每皿10 mL。待瓊脂培養基凝固后，每皿加入10 mL 0.01%中性紅染色液并在暗處保存20 min。將制備好的樣品放入培養皿中，供試品，陰性對照組和陽性對照組各為2皿，每皿放置2個樣品，放入CO2培養箱37℃培養24 h。

2結果

2.1遲發型超敏反應封閉貼敷試驗結果：根據Magnusson和Kligman分級，敷貼試驗反應為無明顯改變，為0級；散發性或斑點狀紅斑，為1級；中度融合性紅斑，為2級；重度紅斑和水腫，為3級。

除去激發敷貼片后48 h進行評分，試驗樣品組和陰性對照組豚鼠激發部位均無明顯改變，根據上述分級標準，兩組等級均為0級。

2.2皮膚刺激試驗結果：根據皮膚反應積分系統，通過反應的紅斑和結痂形成、水腫形成對原發性刺激計分，刺激最高計8分。

紅斑和結痂形成為無紅斑，計0分；極輕微紅斑(勉強可見)，計1分；清晰紅斑，計2分；中度紅斑，計3分；重度紅斑(紫紅色)至焦痂形成，計4分。

水腫形成為無水腫，計0分；極輕微水腫(勉強可見)，計1分；清晰水腫(腫起，不超出區域邊緣)，計2分；中度水腫(腫起約1 mm)，計3分；重度水腫(腫起超過1 mm，并超出接觸區)，計4分。

單次接觸試驗后24 h、48 h、72 h，3只家兔皮膚反應均未出現紅斑和水腫。多次接觸試驗每次在除去敷貼片后1 h以及再次接觸前和末次接觸后的1 h、24 h、48 h、72 h，3只家兔皮膚反應均未出現紅斑和水腫。

2.3細胞毒性試驗(瓊脂擴散法)結果：根據褪色指數及溶解指數評判標準，利用顯微鏡觀察褪色指數和溶解指數。

顯微鏡觀察未發現褪色，褪色指數為0；只有試樣下方褪色，褪色指數為1；褪色邊緣距試樣邊緣小于 5.0 mm，褪色指數為2；褪色邊緣距試樣邊緣在5～10.0 mm內，褪色指數為3；褪色邊緣距試樣邊緣大于 10.0 mm，褪色指數為4；整個培養區褪色，褪色指數為5。

顯微鏡觀察未發現細胞溶解，溶解指數為0；細胞溶解小于20%，溶解指數為1；細胞溶解在20%～40%內，溶解指數為2；細胞溶解在 40%～60%內，溶解指數為3；細胞溶解在60%～80%內，溶解指數為4；細胞溶解大于80%，溶解指數為5。

根據細胞毒性分級標準，細胞反應=褪色指數/溶解指數。細胞反應為0/0，0級，試驗樣品無細胞毒性；細胞反應為1/1，1級，試驗樣品有輕度細胞毒性；細胞反應為2/2至3/3，2級，試驗樣品有中度細胞毒性；細胞反應為4/4至5/5，3級，試驗樣品有重度細胞毒性。

供試品組四個敷貼片均未發現褪色，未發現細胞溶解，細胞反應為0/0，0級，無細胞毒性。陰性對照組四個敷貼片均未發現褪色，未發現細胞溶解，細胞反應為0/0，0級，無細胞毒性。陽性對照組四個敷貼片褪色邊緣距試樣邊緣7 mm，細胞溶解為50%，細胞反應為3/3，0級，中度細胞毒性。

3討論

透明質酸鈉是透明質酸的鈉鹽形式，它具有保濕性、潤滑性、生物相容性、生物可降解性、細胞流動性和細胞附著等功能[4]。對其深加工制成的醫用透明質酸鈉凝膠被廣泛用于眼科手術，防治外傷性或退變性骨關節炎，外科手術等。醫用透明質酸鈉修復貼作為一種新型生物材料，在安全性評價方面未見報道，本試驗通過皮膚致敏試驗，皮膚刺激試驗，細胞毒試驗三種試驗對其進行生物學評價，醫用透明質酸鈉修復貼作為醫療器械使用是安全的。

參考文獻

[1]GB/T 16886.10-2005醫療器械生物學評價 第10部分：刺激與遲發型超敏反應試驗[S].

[2]GB/T 16886.5-2003醫療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗[S].

[3]GB/T 16886.2-2011醫療器械生物學評價 第2部分：動物福利要求[S].

[4]畢瑩，何文龍，李杰新.醫用透明質酸鈉運動粘度的相關因素試驗[J].青島大學學報，2002，17(1)：1-4.

[中圖分類號]R986

[文獻標識碼]A學科分類代碼：35099

收稿日期：2015-08-07

Biological Tests of Medical Sodium Hyaluronate Repair Paste

Wang ZongweiXiao JiayinLi Qingzhong

(Heilongjiang Institute for Food and Drag Control，Harbin 150001，China)

AbstractObjectiveObserving medical sodium hyaluronate repair paste on experimental animal skin sensitization, skin irritation and cytotoxicity, providing scientific basis to evaluate the biological safety of medical uses as its. MethodsOn the basis of the product and the human body contact and contact time, according to the standards of biological evaluation of medical devices of skin sensitization test, skin irritation test, evaluate the bio safety of cell toxicity test.ResultsNo skin sensitization and skin irritation, no cell toxicity. Conclusionmedical sodium hyaluronate repair with clinical for mitigation and compensation injury is safe to use.

Key wordsMedical sodium hyaluronate repair paste；Medical apparatus；Biological safety evaluation