胺碘酮對左室肥厚家兔跨室壁Cx43異質性的影響

林小亮，陸士娟，吳淼，孫定軍，林德洪，黃康，張偉，鐘江華

（1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院心血管內科，海南 海口 570208；2.海口市第四人民醫院內科，海南 海口 570208）

胺碘酮對左室肥厚家兔跨室壁Cx43異質性的影響

林小亮1，2，陸士娟1，吳淼1，孫定軍1，林德洪1，黃康1，張偉1，鐘江華1

（1.中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院心血管內科，海南 海口 570208；2.海口市第四人民醫院內科，海南 海口 570208）

目的 觀察胺碘酮片劑對左室肥厚(LVH)家兔三層心肌間Cx43表達的差異，探討LVH惡性室性心律失常(MVA)的機制及處理措施。方法 將20只家兔按隨機數字法分成胺碘酮治療組和LVH對照組，每組各10只。兩組家兔均采用傳統的腹主動脈縮窄術后繼續喂養8周以制備LVH模型。治療組手術后給予經口喂服鹽酸胺碘酮片，每日50 mg/kg，連續4周，然后繼續喂養4周并進行實驗；對照組喂養生理鹽水8周后進行實驗。分別檢測兩組家兔心外膜下、中層心肌和心內膜下心肌細胞的單相動作電位復極90%時程(APD90)、跨室壁復極離散度(TDR)以及左心室三層心肌Cx43蛋白表達的差異。結果(1)治療組家兔心內、外膜下、中層心肌的APD90分別為(275.30±11.42)ms、(251.50±10.98)ms和(295.40±12.41)ms，均較LVH對照組的(236.30±16.51)ms、(217.69±14.25)ms和(265.12±20.01)ms顯著延長，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，但是治療組的TDR為(38.96±10.91)，明顯小于對照組的(48.56±11.23)，差異有統計學意義(P＜0.05)。(2)治療組家兔三層心肌的Cx43蛋白表達分別為(0.60±0.07)、(0.48±0.05)和(0.57±0.06)，均較對照組的(0.53±0.04)、(0.31±0.06)和(0.48±0.04)明顯提高(P＜0.05)，但以中層心肌的增加更為明顯，從而縮小了三層心肌間Cx43蛋白表達的差異，△Cx43減少[(0.14±0.06)vs(0.23±0.08)，P＜0.01]。結論 胺碘酮能改善左室肥厚的跨室壁Cx43表達異質性，縮小左心室心肌跨室壁復極不均一性，這可能是其減少MVA發作的生理機制。

中層心肌；縫隙連接蛋白43；左室肥厚；胺碘酮

高血壓患者后期往往伴發左心室肥厚(LVH)，而LVH已被證實容易發生惡性室性心律失常(MVA)而致心源性猝死(SCD)，其處理主要以藥物治療為主。而抗心律失常藥物在抑制MVA的同時又有致MVA的作用，因此評估和探討抗心律失常藥物的致MVA作用及機制有重要的臨床意義。

胺碘酮是臨床常用的Ⅲ類抗心律失常藥，廣泛應用于許多器質性心臟病惡性室性心律失常(MVA)的治療。近年來的研究進一步表明，胺碘酮與其他抗心律失常藥物如普羅哌酮、英卡胺等不同，在抑制MVA的同時并無明顯的致MVA作用，這可能與其未增加左心室心肌的跨室壁復極不均一性有關[1-2]。我們的研究主要觀察胺碘酮對高血壓LVH三層心肌間動作電位和Cx43蛋白表達的影響，探討胺碘酮治療LVH MVA的機制，為器質性心臟病MVA的處理提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 將20只體質量2.0～3.0 kg的新西蘭大白兔(雌雄不限)按隨機數字法分為對照組和治療組，每組10只。所有家兔均采用傳統的腹主動脈結扎術后繼續喂養8周以制作LVH模型。對照組手術后經口連續喂服生理鹽水8周，而治療組手術后則喂服鹽酸胺碘酮片，每天50 mg/kg，連續4周，停藥繼續喂養4周后進行實驗。

1.2 試劑 配制成分：氯化鈉(NaCl)115 mmol/L，氯化鉀(KCl)5.4 mmol/L，氯化鎂(MgCl2)1 mmol/L，氯化鈣(CaCl2)1.8 mmol/L，磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 1 mmol/L，羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L的正常臺式液，并以NaOH調整其pH值至7.4。

1.3 心臟電生理實驗 快速切取家兔模型的心臟，并在4℃臺式液的條件下停搏。主動脈插管后進行Langendorff恒溫恒壓灌注。自制三層心肌簡易電極，通過醫用注射器針頭分別固定在心內膜下心肌、心外膜下心肌和中層心肌組織間。破壞心臟竇房結后以1 000 ms固定起搏右心室。正常臺式液穩定灌流20 min后記錄三層心肌組織的單相動作電位(MAP)。以MAP 0期至復極到振幅90%的水平距離作為APD時程(APD90)，以左心室壁內三層心肌間最長與最短的APD90差值為跨室壁復極離散度(TDR)。

1.4 實驗后處理 稱量心臟濕重，測量左心室壁厚度，并行左心室心肌組織病理切片。

1.5 提取蛋白質 剪取左心室游離壁并通過快速冰凍切片方法[3]提取三層心肌組織：分別在心內膜下(Endo)、心外膜下(Epi)和中層心肌(Mid)處連續切片10次，每片20 μm(共200 μm)。將切取的三層心肌組織保存在Eppendorf管內，勻漿后以12 000 r/min，4℃離心30 min，取上清液并檢測蛋白濃度。

1.6 Cx43蛋白表達檢測 采用Western blot方法檢測三層心肌間Cx43蛋白表達。提取足量蛋白質后根據樣品濃度上樣，進行SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳后轉PVDF膜，將PVDF膜放入5%TBST脫脂牛奶中在室溫下封閉2 h，滴加Cx43單克隆抗體后置于4℃冰箱內過夜，然后加入辣根過氧化物酶標記的二抗并繼續在室溫下孵育2 h，采用增強化學發光的方法將PVDF膜顯色后顯影于X線膠片上。用凝膠圖像分析系統獲取蛋白質信號條帶圖像后測定目的蛋白Cx43和內參GAPDH的光密度值，計算兩者的比值作為Cx43蛋白的表達水平。計算三層心肌間最大與最小的Cx43蛋白差值為跨室壁Cx43表達差異(ΔCx43)

1.7 統計學方法 本實驗為完全隨機設計資料，所有數據均以均數±標準差(±s)表示，并使用統計軟件SPSS13.0進行統計分析。各組數據均分別行正態性檢驗或Levene's test方差齊性檢驗，采用獨立樣本t檢驗對兩個樣本均數進行對比，多個樣本均數之間的比較則采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。以α=0.05(雙側)為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組間基礎改變比較 兩組間家兔的心重/體質量指數、左心室重量和左室壁厚度，病理切片結果均符合LVH的表現，見表1。

表1 胺碘酮對LVH家兔基礎變化的影響(±s)

表1 胺碘酮對LVH家兔基礎變化的影響(±s)

組別 心重(g)體質量(kg)心重/體質量(g/kg)左室游離壁厚度(mm)治療組(n=10)對照組(n=10)檢驗值P值6.39±0.34 6.41±0.31 1.368＞0.05 1.73±0.12 1.71±0.09 1.822＞0.05 3.70±0.27 3.74±0.20 1.269＞0.05 5.96±0.42 5.86±0.43 1.435＞0.05

2.2 兩組間跨室壁復極異質性比較 治療組三層心肌的APD90均較對照組顯著延長(P＜0.01)。但胺碘酮治療組的TDR顯著小于LVH對照組，表明胺碘酮雖然延長了LVH家兔的三層心肌APD90，但卻縮小了三層心肌之間的跨室壁復極異質性，見表2。

表2 胺碘酮對LVH家兔電生理參數的影響(ms，±s)

表2 胺碘酮對LVH家兔電生理參數的影響(ms，±s)

組別Endo-APD90Mid-APD90Epi-APD90TDR治療組(n=10)對照組(n=10)檢驗值P值275.30±11.42 236.30±16.51 4.813＜0.01 295.40±12.41 265.12±20.01 5.026＜0.01 251.50±10.98 217.69±14.25 4.964＜0.01 38.96±10.91 48.56±11.23 2.803＜0.05

2.3 兩組間跨室壁Cx43表達異質性的比較 治療組三層心肌Cx43蛋白表達均較LVH對照組有顯著增加(P均＜0.05)，且ΔCx43縮小(P＜0.01)，表明胺碘酮在改善LVH三層心肌Cx43蛋白表達的同時還能夠使Cx43蛋白跨室壁表達異質性下降作用，見表3和圖1。

表3 胺碘酮對LVH家兔三層心肌間Cx43表達的影響(±s)

表3 胺碘酮對LVH家兔三層心肌間Cx43表達的影響(±s)

組別治療組(n=10)對照組(n=10)檢驗值P值Endo-Cx43 0.60±0.07 0.53±0.04 2.662＜0.05 Mid-Cx43 0.48±0.05 0.31±0.06 4.912＜0.01 Epi-Cx43 0.57±0.06 0.48±0.04 2.904＜0.05 ΔCx43 0.14±0.06 0.23±0.08 3.428＜0.01

圖1 胺碘酮對LVH跨室壁Cx43表達的影響

3 討論

近年來的臨床數據表明，高血壓合并LVH的患者容易發生惡性室性心律失常(MVA)，這是高血壓LVH猝死的重要原因[4]。而LVH發生MVA的病理生理基礎并不完全清楚，可能與LVH的心肌間血管分布失衡導致心肌缺氧，且心肌間存在明顯炎癥和纖維化，心肌細胞和組織間質發生改變，心臟自主神經功能的穩定性降低等相關。以上這些因素都會增加左心室心肌的電活動不穩定，從而容易誘發MVA致SCD[5]。LVH心電的不穩定是多種形式的，有研究顯示：LVH時左心室三層心肌APD明顯延長，但中層心肌APD的延長更為明顯，TDR增大，跨室壁復極不均一性增加，早后除極的異位心電容易在三層心肌間折返而誘發MVA[6]。APD的延長可能與心室肌細胞上延遲整流鉀電流(Ik)的減弱有關，而心室肌橫斷面上不同部位的Ik慢電流成分Iks的差異卻是左心室三層心肌間復極時程不均一性增加，容易誘發折返性室性心律失常的基礎[7]。

胺碘酮是臨床常用的抗室性心律失常藥物，主要通過阻斷心肌細胞上的鉀離子通道，延長動作電位時程而發揮作用。但其又有別于其他的Ⅲ類抗心律失常藥，還具有抗纖顫及抗交感神經等多種電生理效應。近年來的研究表明，胺碘酮與其他抗心律失常藥物索他洛爾、普羅哌酮、英卡胺等不同，在抑制MVA的同時并無明顯的致MVA作用，這可能是因為它同時抑制延遲整流鉀電流的快、慢成分(Ikr、Iks)[8]，縮小三層心肌間Iks的差異，減小跨室壁復極的不均一性，因此其致MVA的作用較小。本實驗結果也表明，胺碘酮治療組左心室心內外膜下心肌和中層心肌的APD90均較LVH對照組顯著增大，但是TDR卻明顯小于LVH對照組，也顯示胺碘酮在延長心肌復極時程的同時，還使三層心肌之間的復極異質性縮小，有改善復極離散的作用。

心肌組織Cx43蛋白是心電活動的分子基礎，MVA的發生與Cx43蛋白的重構密切相關，而且Cx43在心肌細胞分布的數量與空間上也存在差異，這種差異是器質性心臟病跨室壁復極異質性增加的基礎[9]。本實驗中我們的蛋白質分析結果進一步顯示，與LVH對照組比較胺碘酮治療組心內外膜下心肌、中層心肌的Cx43蛋白表達均明顯增加，且中層心肌的增加更為顯著，從而縮小了三層心肌間Cx43表達的差異，ΔCx43進一步縮小，這可能是胺碘酮改善LVH跨室壁復極不均一性的蛋白分子機制。

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Effects of amiodarone on transmural heterogeneous of Cx43 in rabbits with left ventricular hypertrophy.

LIN Xiao-liang1,2,LU Shi-juan1,WU Miao1,SUN Jing-jun1,LIN De-hong1,HUANG Kang1,ZHANG Wei1,ZHONG Jiang-hua1.1.Department of Cardiology,Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School of Medicine,Central South University,Haikou 570208,Hainan,CHINA;2.Department of Internal Medicine,the Fourth People's Hospital of Haikou, Haikou 570208,Hainan,CHINA

Objective To observe the effects of feeding amiodarone on heterogeneity of Cx43 expression in the rabbit model with left ventricular hypertrophy(LVH),and investigate the mechanisms of amiodarone on malignant ventricular arrhythmias(MVA)induced by LVH.Methods Twenty rabbits were randomly divided into LVH group (n=10)and amiodarone group(n=10).LVH model was produced with traditional abdominal aortic coarctation in the both group.Rabbits in the LVH group were continuing to feed for 8 weeks after surgery,and given feeding amiodarone tablets[50 mg/(kg·d)]for four consecutive weeks after surgery in the amiodarone group.90%monophasic action potential repolarization duration(APD90)of subepicardial,midmyocardial and subendocardial myocardium,transmural dispersion of repolarization(TDR)and Cx43 protein expression in three layers of myocardium were measured in both groups.Results(1)APD90 of endomyocardial,epimyocardial and midmyocardiallayers in the amiodarone group were(275.30±11.42)ms,(251.50±10.98)ms and(295.40±12.41)ms respectively,which significantly prolonged than those in the LVH group of(236.30±16.51)ms,(217.69±14.25)ms and(265.12±20.01)ms(P＜0.01).However,TDR were significantly decreased in the amiodarone group[(38.96±10.91)vs(48.56±11.23),P＜0.05].(2)Three myocardial Cx43 protein expression in the amiodarone group were(0.60±0.07),(0.48±0.05)and(0.57±0.06)respectively,which significantly increased compared to those in the LVH group[(0.53±0.04),(0.31±0.06)and(0.48±0.04)],P＜0.05.Increasing of midmyocardial Cx43 was more significant,so difference of Cx43 among three myocardium reduced and△Cx43 decreased[(0.14±0.06)vs(0.23±0.08),P＜0.01].Conclusion Amiodarone can reduce MVA in LVH by decreasing ransmural heterogeneity of Cx43 protein expression and improving transmural dispersion of repolarization.

Midmyocardium;Cx43;Left ventricular hypertrophy(LVH);Amidarone

R-332

A

1003—6350（2016）15—2416—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.15.003

2016-05-27)

海南省衛生廳基金項目(編號：瓊衛2013資助-011)；海口市人民醫院院內項目(編號：2013-YQL-13)

鐘江華。E-mail：435833825@qq.com