白細胞介素17在多發性硬化中的作用

解麗麗 李福榮 隋曉雯 王梓晗 王翠 呂洪濤

白細胞介素17在多發性硬化中的作用

解麗麗 李福榮 隋曉雯 王梓晗 王翠 呂洪濤

目的 通過檢測多發性硬化（MS）患者與健康人的血清白細胞介素17（IL-17）水平，研究IL-17水平與MS之間的關系。方法 收集27例MS患者和27例健康人的血清，采用酶聯免疫吸附劑法（ELISA）檢測樣品吸光度，計算出IL-17水平。結果 MS組的血清IL-17水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論 MS患者組的血清IL-17水平高于對照組。

多發性硬化；白細胞介素17；酶聯免疫吸附劑法

多發性硬化（MS）是一種病因尚未明確的，易發于中青年患者的中樞神經系統(CNS)炎性脫髓鞘性自身免疫性疾病，主要以CNS多發性白質和皮質下病灶所導致的復發和進展性神經癥狀為特征[1]。病理特點為CNS內血管周圍的淋巴/單核細胞浸潤，脫髓鞘斑塊形成，反應性膠質疤痕形成和軸突損傷[2]。MS是受環境因素的觸發由CD4+T細胞介導的中樞神經系統的自身免疫性疾病[3]。自身抗體能夠反映自身免疫反應的表型、本質和強度[4]。已有研究提示白細胞介素17（IL-17）在自身免疫性疾病的產生和發展中發揮重要的作用[5]。因此，本研究以MS為研究對象，探討IL-17在MS患者外周血清中的表達情況，研究IL-17與MS發病機制的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院神經內科2012年12月～2014年12月收治的MS急性期患者27例作為MS組，其中男14例，女13例，年齡22～65歲，平均（41.5±9.5）歲。其中6例是首次發作，其余均為2次以上發作。所有臨床病例均符合McDonald多發性硬化診斷標準[6]:臨床表現≥2次發作；具有≥1個以上客觀臨床證據的病變或存在1個客觀臨床證據的病變，同時伴有既往發作，合理的病史證據，無需臨床資料。臨床表現≥2次發作；具有1個病變的客觀臨床證據，在CNS的4個MS典型區域（腦室周圍，近皮質，幕下和脊髓）中至少有2個區域≥1個T2病變；或者CNS不同部位病變的臨床發作。1次發作；具有≥2個病變的客觀臨床證據，同時存在無癥狀的增強與非增強的病變。有1次發作；存在1個病變的客觀臨床證據，且具有證據病變空間和時間多發的證據。提示MS的隱匿的神經功能障礙進展（原發進展型MS），疾病進展1年同時有下列3項中的2項：（1）腦病變的空間多發證據；（2）脊髓病變的空間多發證據；（3）腦脊液陽性，等電聚焦電泳的寡克隆帶證據。無其他免疫系統相關疾病，不合并腫瘤、急性炎性疾病引起的自身免疫反應性疾病，沒有近期內感染和組織損傷，無3個月內接受免疫抑制劑治療的患者，無孕婦。選取同期健康志愿者27例作為對照組，其中男14例，女13例，年齡21～57歲，平均（36.5±14.6）歲。MS組與對照組的性別和年齡差異無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗試劑和儀器 人IL-17酶聯免疫試劑盒（上海信裕生物技術有限公司）。常溫離心機（Eppendorf公司，美國），微量移液器（Eppendorf公司，美國），METERTECM∑960酶標儀（上海醫療器械七廠），BD-132冰箱（海爾公司，青島），37℃細胞培養箱（Shel Lab，美國）。

1.2.2 樣本采集 空腹采集肘部靜脈血5mL，存放于EDTA促凝試管中，之后放在4℃冰箱2h，等待血液凝固上下分層后，放到高速離心機中，3000r/min，離心5min，吸取上層血清，使用移液器將血清移到2mL試管中，-20℃冰箱內儲存備用。

1.2.3 ELISA檢測步驟 從冰箱取出IL-17抗體ELISA試劑盒，放于室溫30min。準備標準品：在標準品中加入150μL的稀釋液，調整到20ng/L濃度，然后倍比稀釋，分別稀釋為5個濃度：20、10、5、2.5、1.25ng/L。將標準品和血清樣品各稀釋5倍，每孔加40μL的稀釋液，然后加入10μL樣品，均勻振蕩。用封板膜密封后，37℃孵育30min。揭開封板膜，去掉液體，甩干，每孔加入洗滌液，放置30s后棄掉，反復洗滌5次，干燥。每孔（空白孔除外）加入酶標試劑50μL。再次進行之前步驟。每孔依次加入顯色劑A、B各50μL，搖勻后避光顯色20min。每孔加入終止液50μL，終止反應。設置空白孔為0、450nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.2.4 結果分析 制作標準曲線，根據各個樣品的OD值代入標準曲線方程，測得各個樣品的濃度。

1.3 統計學方法 應用SPSS19.0軟件進行統計分析。計量資料以“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

MS患者血清IL-17水平為（16.35±4.25）ng/L，正常人血清中IL-17水平為（6.15±0.52）ng/L；MS組與對照組IL-17水平相比，差異有統計學意義（t=5.923，P=0.019）。

3 討論

IL-17是Rouvier在1993年從激活的T細胞雜交瘤中克隆出來的CTLA8的cDNA序列，其相關蛋白質被命名為IL-17[7]。IL-17是有輔助T細胞Th17分泌的特征性細胞因子，在抵抗胞外細菌、真菌感染的宿主防御和其他各種自身免疫性疾病發展中起到重要作用。在人類的疾病研究中發現，IL-17在MS的外周血和病變局部組織表達上調，并且在疾病的慢性、復發過程中發揮關鍵的作用[8]。

MS是一種T細胞介導的慢性炎癥性脫髓鞘性疾病。越來越多的證據表明,IFN-β和IL-17等細胞因子在MS發病的過程中發揮重要作用[9-11]。本研究結果顯示，MS組患者血清IL-17水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明IL-17存在于MS的發病過程，但是其變化是MS發病的原因，還是MS發病后導致的結果，具體的機制研究尚不清楚。但是MS患者血清中IL-17表達明顯升高，可以作為臨床早期篩查MS患者的生物標志物，對于盡早發現MS患者的病情起到積極的作用，可以作為MS的診斷、分類、疾病活動性和預測臨床進程的潛在的生物標志物。

[1] Segal BM.Th17 cells in autoimmune demyelinating disease[J].Semin Immunopathol,2010,32(1):71-77.

[2] Dhib-Jalut S.Pathogenesis of myelin/oligodendrocyte damage in multiple sclerosis[J].Neurology,2007,68(22):S13-21.

[3] Noseworthy JH,Lucchinetti C,Rodriguez M,et al.Multiple sclerosis[J].N Engl J Med,2000,343:938-952.

[4] Ilawa M,Beyan ll,Leslie RD.Principles of autoantibodies as diseasespecific markers[J].Autoimmunity,2004,37:253.

[5] Thamilarasan M,Koczan D,Hecker M,et al.MicroRNA in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Autoimmun Rev,2012,11(3):174-179.

[6] CH Polman,S Reingold,B Banwell,et al.Diagnostic criteria for multiple sclerosis:2010 revisions to the McDonald criteria[J].Ann Neurol,2011,69 (2):292-302.

[7] Vaknin-Dembinsky A,Balashov K,Weiner HL.IL-23 is increased in dendritic cells in multiple sclerosis and down-regulation of IL-23 by antisense oligos increases dendritic cell IL-10 prodution[J]. Immunol,2006,176(12):7768-7774.

[8] Weissert R.The immune pathogenesis of multiple sclerosis[J].J Neuroimmune Pharmacol,2013,8(4):857-866.

[9] Gra?yna MW,Justyna BL,Zofia L,et al.Interleukin 17 receptor in multiple sclerosis patients treated with interferon β-1a[J].Folia Neuropathol 2011,49(2):138-141.

[10] Freedman MS,De Stefano N,Barkhof F,et al.Patient subgroup analyses of the treatment effect of subcutaneous interferon β-1a on development of multiple sclerosis in the randomized controlled REFLEX study[J].J Neurol,2014,261(3):490-499.

[11] Yamout B,Alroughani R,Al-Jumah M,et al.Consensus guidelines for the diagnosis and treatment of multiple sclerosis[J].Curr Med Res Opin,2013,29(6):611-621.

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.4.024

遼寧116033 大連市中心醫院神經內科 （解麗麗 李福榮 隋曉雯 王梓晗 王翠） 116011 大連醫科大學附屬第一醫院神經外科 （呂洪濤）

呂洪濤 E-mail：lht_725@163.com