雞新城疫病毒的分離和鑒定

馮芳萍

(山西省呂梁市離石區(qū)農委畜牧獸醫(yī)技術站，山西 呂梁 033000)

雞新城疫病毒的分離和鑒定

馮芳萍

(山西省呂梁市離石區(qū)農委畜牧獸醫(yī)技術站，山西 呂梁 033000)

旨在為發(fā)病雞場找到致病原，本研究利用SPF雞胚從發(fā)病雞組織中分離到1株病毒，病毒對1%雞紅細胞的血凝價為28，病毒的ELD50為107.83/0.1 mL，病毒可以被新城疫病毒陽性血清特異性中和，攻擊該病毒的SPF雞表現(xiàn)出典型的新城疫病毒感染癥狀，RT-PCR鑒定顯示該病毒為新城疫病毒。

雞新城疫病毒；分離；鑒定

雞新城疫（Newcastledisease，ND）又稱亞洲雞瘟，是由雞新城疫病毒（Newcastle diseasevirus，NDV）引起禽類的一種以呼吸道、消化道黏膜出血為主要病變特征的急性、敗血性、高度接觸性傳染病[1]。近年來隨著我國養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，新城疫免疫失敗顯現(xiàn)不斷增加，新城疫成為目前規(guī)模養(yǎng)殖場最容易發(fā)生的病毒性傳染病之一。本研究對臨床表現(xiàn)為全身黏膜和漿膜出血、腸道淋巴結腫脹出血、腺胃黏膜水腫、乳頭出血、氣管有出血和壞死的疑似新城疫病毒感染病例進行病毒的分離與鑒定，為發(fā)病雞場找到致病原和制定綜合防治措施提供了參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 雞胚、雞、血清

10日齡SPF雞胚、2月齡SPF雞均購自濟南斯帕法斯家禽有限公司；新城疫病毒陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 病料樣品的采集與處理

無菌采取病死雞的氣管、淋巴結等組織病料按1：3加入生理鹽水，用研磨器反復研磨，12 000 r/min離心10 min，取上清液依次加入終濃度分別為2 000 IU/mL的青霉素、鏈霉素和卡那霉素，置于4℃放置6 h，即得處理后的病料樣品。

1.3 病毒分離傳代

將處理后的病料樣品接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2 mL/胚，棄去24 h死亡的雞胚，收集24 h之后死亡的雞胚尿囊液，傳3代，收集每一代的死亡雞胚尿囊液，取第3代病毒尿囊液做下面的毒株鑒定。

1.4 分離毒株血凝性測定

按照常規(guī)血凝實驗方法測定第3代分離毒對1%雞紅細胞的凝集性。

1.5 分離毒株雞胚半數(shù)致死量（ELD50）的測定

將第3代病毒尿囊液做10倍系列稀釋，取10-6，10-7，10-8三個稀釋度分別接10日齡SPF雞胚5枚，棄去24h死亡的雞胚，記錄接種后24 h死亡且胎兒病痕明顯的雞胚，按Reed-Muench法計算ELD50。

1.6 中和試驗

將第3代病毒尿囊液與等量新城疫病毒陽性血清混合，室溫中和1 h后，接種10日齡SPF雞胚10枚，0.2 mL/胚，棄去24 h死亡的雞胚，觀察雞胚死亡情況，至120 h，取所有活胚尿囊液做凝集實驗。

1.7 動物回歸試驗

將分離的第3代病毒接種健康2月齡SPF雞10只，每只雞氣管內注射0.1mL，觀察接種后雞的發(fā)病情況。

1.8 RT-PCR鑒定

將分離的第3代病毒按照參考文獻[3]的方法提取病毒基因組RNA，并按照文獻[2]中的RT-PCR反應程序進行PCR擴增，RT-PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結果與分析

2.1 病毒分離與胚體病變觀察結果

雞胚接種病料樣品后48 h開始出現(xiàn)死亡，一般在72～96 h死亡較多，取死亡雞胚剖檢可見全身有出血點，雞胚縮小，發(fā)育不良。

2.2 血凝性的測定結果

通過血凝實驗，測定第3代分離毒的血凝價為28。

2.3 ELD50的測定結果

第3代分離毒的ELD50為107.83/0.1 mL。

2.4 中和試驗結果

第3代分離毒與新城疫陽性血清中和后，接種10日齡SPF雞胚10枚全部健活，活胚尿囊液對1%雞紅細胞無凝集性，說明分離毒株可以被新城疫病毒陽性血清特異性中和。

2.5 動物回歸試驗結果

第3代分離毒接種健康SPF雞后，接種第3 d開始發(fā)病，發(fā)病雞食欲下降，精神萎靡，翅下垂，眼半閉半睜，后期出現(xiàn)咳嗽和呼吸困難，5 d后全部死亡。剖檢死亡雞可見全身出血，消化道和呼吸道出血明顯。

2.6 RT-PCR鑒定結果

PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，在511 bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，與預期大小一致，說明擴增產物為新城疫病毒的特異性序列，分離毒株為新城疫病毒。

3 討論

本研究通過對現(xiàn)地感染的病雞病變組織處理后接種10日齡SPF雞胚，通過對分離毒進行血凝性，中和試驗，ELD50測定和動物回歸試驗及RT-PCR檢測，最終確定雞場感染新城疫病毒，為發(fā)病雞場找到致病原及綜合防制奠定了基礎。新城疫病毒是家禽最常見的病毒性傳染病，各種家禽普遍易感，各種年齡雞都可感染，幼雞和雛雞更易感。本病春秋兩季高發(fā)，雞群一旦發(fā)生強毒感染，一般很難凈化。新城疫的防治主要通過疫苗免疫接種，制定科學合理的免疫程序對新城疫的防控至關重要。免疫雞群也可以發(fā)生新城疫病毒感染，往往由于母源抗體干擾免疫效果導致免疫失敗[3]，因此，新城疫疫苗免疫要掌握好免疫時機，避開母源抗體高峰期，一般可以對雞群的母源抗體效價進行監(jiān)測，如果抗體效價高于25則不產生免疫應答，在23的時候免疫接種可以產生良好的免疫效果。平時需要做好養(yǎng)殖場的環(huán)境衛(wèi)生，保持雞舍的溫度，通風良好，一旦發(fā)生患病雞要及時隔離。此外，防治新城疫要采取嚴格的生物安全措施，加強引種方面的監(jiān)管，防止新城疫強毒進入家禽群，做好定期的免疫接種工作，提高禽群特異性免疫效果。

[1]肖華平,黃忍,魏培,等.新城疫病毒的最新研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32(4)：43，87.

[2]梁瑾,程福亮,陳甜甜,等.新城疫病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立及初步應用[J].中國生物制品學雜志, 2013,26（2）：265-267.

[3]劉孝霖,馬金松,劉學洪.雞新城疫免疫失敗的原因及對策[J].當代畜牧,2016（1）：8-9.

(編輯：張淑鳳)

S852.659.5

B

1006-799X(2016)21-0095-01

馮芳萍（1968-），女，山西呂梁人，獸醫(yī)師，主要研究方向為畜牧獸醫(yī)。