美國沃倫·阿爾波特基金獎概覽(下)

朱安遠,郭華珍

(1.北京金自天正智能控制股份有限公司 市場營銷中心,北京 100070；2.中國康復研究中心北京博愛醫院 康復評定科,北京 100068)

美國沃倫·阿爾波特基金獎概覽(下)

朱安遠1,郭華珍2

(1.北京金自天正智能控制股份有限公司 市場營銷中心,北京 100070；2.中國康復研究中心北京博愛醫院 康復評定科,北京 100068)

在美國頒發的知名國際生物醫學大獎中,沃倫·阿爾波特基金獎的權威性和名望聲譽僅次于享有“諾貝爾獎的風向標”之盛譽的拉斯克獎,1987年以來阿獎共頒發過28屆(1990年未頒獎,2008年和2009年合為1屆頒獎),獲獎者共計59人(其中女性得主5人,尚無雙料得主和組織機構得主),其中諾獎得主8人,拉獎得主18人。2011年和2015年中國中醫科學院首席研究員屠呦呦先后摘取拉斯克臨床醫學研究獎和沃倫·阿爾波特基金獎,這是她日后最終成功問鼎諾醫獎的前奏曲,屠呦呦先生接連斬獲3項世界級大獎,從而鎖定了她在醫學科學界的“青蒿素之母”的崇高地位。對生命科學領域當今炙手可熱的基因組編輯技術CRISPR-Cas9的發展軌跡及其發明專利權之爭予以概括性介紹。

哈佛大學；哈佛醫學院(HMS)；沃倫·阿爾波特基金會；沃倫·阿爾波特基金獎(WAFP/AFP,阿獎)；拉斯克獎(拉獎)；拉斯克基礎醫學研究獎(LBM)；拉斯克臨床醫學研究獎(LCM)；諾貝爾獎(諾獎)；諾貝爾自然科學獎；諾貝爾生理學或醫學獎PM(諾醫獎)；諾貝爾化學獎CH(諾化獎)；諾貝爾和平獎PE(諾和獎)；屠呦呦；青蒿素；基因組編輯技術CRISPR-Cas9；發明專利權

5 基因組編輯技術CRISPR-Cas9與沃倫·阿爾波特基金獎及其發明簡史[1～5]

微生物分為真核類、原核類和非細胞類(如各種病毒)三大類。在生物學家們的顯微鏡下,酵母細胞是真核生物的代表,大腸桿菌則是原核生物的代表。日本分子細胞生物學家大隅良典(2016PM)通過對酵母細胞的深入研究,“因他發現細胞自噬的機制”而獨享2016年諾貝爾生理學或醫學獎。

糖類(曾稱碳水化合物,如糧食中的淀粉)、蛋白質、脂肪和核酸是構成生命體的四大類大分子有機物(高分子化合物)。

基因(gene,即遺傳因子)是控制生物性狀的基本遺傳單位,是指具有遺傳效應的脫氧核糖核酸(DNA)片段,部分病毒(如煙草花葉病毒和艾滋病毒HIV等)的遺傳物質則是核糖核酸(RNA)。基因支撐著生命的基本構造和性能,儲存著生命的種族、血型、孕育、生長和凋亡等過程的全部信息。

在分子生物學和分子遺傳學領域,基因組編輯(又稱基因組剪接、基因組修飾、基因組加工,genome editing)技術是一種可以在基因組水平上利用特異性核酸酶對目標DNA序列進行定點修飾加工的遺傳操作技術。這種技術的原理是構建一個人工內切酶EEN(內切酶的全稱是限制性核酸內切酶,又稱限制性核酸酶,engineered endonuclease)作介導,在預定的基因組位置切斷DNA,被切斷的DNA在被細胞內的DNA修復系統的修復過程中會產生突變,從而達到定點編輯改造目標基因組的目的。核酸酶引起的DNA雙鏈斷裂DSB(double-strand breaks)可通過以下2種不同途徑予以修復：非同源末端連接NHEJ(non-homologous end joining)和同源重組型修復HDR(homology directed repair),由此基因組編輯技術可實現以下3種基因組改造目的：基因敲除、特異突變的引入和定點轉基因。

1989年首例采用同源重組HR(homologous recombination)技術產生的基因打靶小鼠(Mus musculus)問世,這是2007年諾醫獎的獲獎成果。雖然HR技術在小鼠模型中被廣泛使用,但這項技術效率很低且在大部分物種中難以推廣應用。[6]

2016年3月9日阿獎官網發布公告,將當年沃倫·阿爾波特基金獎授予以下對基因組編輯技術CRISPR-Cas9做出開創性基礎貢獻的5位科學家：①美國北卡羅來納州立大學的法國微生物學家巴蘭古(Rodolphe Barrangou,1975—)；②UCB美國女生物化學家杜德娜(Jennifer Anne Doudna,1964—)；③杜邦法國公司的法國營養和健康專家霍瓦特(Philippe Horvath,1970—)；④維爾紐斯大學生物技術研究所的立陶宛生物化學家斯克尼斯(Virginijusik?nys/Siksnys,1956—)；⑤馬克斯·普朗克感染生物學研究所(柏林)和瑞典于默奧大學的法國女微生物學家、遺傳學家和生物化學家卡彭蒂埃(又譯為卡彭蒂耶、夏龐蒂埃、夏邦杰,Emmanuelle Marie Charpentier,1968—),表彰“他們對CRISPR細菌防御系統的認識及其適用于基因組編輯的革命性發現做出卓越貢獻”(for their remarkable contributions to the understanding of the CRISPR bacterial defense system and the revolutionary discovery that it can be adapted for genome editing)。哈佛醫學院院長兼阿爾波特基金會科學顧問委員會主席弗萊爾說“這5位科學家極具變革性的洞察力帶來了一項為全球所迅速擁抱的技術,改變了我們研究和理解真核生物遺傳學的方式,為開發新的基因和細胞療法提供了巨大的潛力”。霍瓦特和巴蘭古發現細菌通過一種被稱為CRISPR的系統切掉入侵病毒的DNA特定片段來保護自己,避免遭受病毒等病原體的破壞；杜德娜、卡彭蒂埃和斯克尼斯則在他們發現的基礎上,認識到CRISPR系統可在包括人類等眾多生物體的任意基因序列上進行編程,這一極具目的性的“剪接”可用來隨意改變或替換靶向DNA。CRISPR技術的優化者和延展應用者(如張鋒和切奇等)則無緣阿獎。此前,UCB霍華德·休斯醫學研究所(Howard Hughes Medical Institute)和勞倫斯伯克利國家實驗室(Lawrence Berkeley National Laboratory)的杜德娜以及德國感染研究赫爾姆霍茨中心(Helmholtz Center for Infection Research)和瑞典于默奧大學的卡彭蒂埃因這一貢獻已共享2015年度生命科學突破獎(Breakthrough Prize in Life Sciences,每年頒獎1次,始頒于2013年,因其獎金高于諾獎而被譽為“豪華版諾貝爾獎”),她倆將均分300萬美元獎金,其獲獎理由是“因利用細菌免疫性的古老機制而開發出基因組編輯這樣的一個強大而通用技術,具有廣泛的跨生物學和醫學意義”(for harnessing an ancient mechanism of bacterial immunity into a powerful and general Technology for editing genomes,with wide-ranging implications across biology and medicine)。卡彭蒂埃/杜德娜還被列入2015年度化學領域的湯森路透引文桂冠名單(Thomson reuters citation laureates,始于1989年,素有“諾貝爾獎的風向標”之稱)。

5.1 CRISPR系統的發現

科研人員后來通過文獻檢索追溯才發現,早在1987年日本大阪大學微生物學家和分子生物學家石野良純(Yoshizumi Ishino,1957—)小組在克隆K12大腸桿菌堿性磷酸酶同工酶(alkaline phosphatase isozyme=iap)的基因編碼序列時,就意外地發現編碼序列附近存在特殊的串聯間隔重復(5個)的DNA片段,每個重復片段含29個保守堿基且具有內部堿基互補的回文結構,這些保守片段之間由32個堿基的居間序列隔開,當時人們對這種結構的生物學功能還是一無所知。[7]1993年西班牙阿利坎特大學微生物學家馬丁內斯·莫奇卡(Francisco Juan Martínez Mojica,1963—)小組在對地中海極嗜鹽菌(Haloferax mediterranei)和沃爾卡尼極嗜鹽菌(Haloferax volcanii)的研究中發現了這種串聯間隔重復序列[8～9],1990年代中后期科學家們陸續發現這種類似結構廣泛存在于古細菌和細菌的基因組中(現有基因測序結果表明,約90%的古細菌綱和40%的細菌綱的基因組或質粒中至少存在1個CRISPR位點/基因座,有的甚至含有2個或3個位點),2000年稱其為短規律性間隔重復SRSR(short regularly spaced repeat)序列[10],2002年荷蘭烏得勒支大學揚森(Ruud Jansen)等人將其正式命名為成簇規律性間隔短回文重復CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)序列[11],它構建一種特殊的防御系統,能有效地抵抗噬菌體和外界各種基因元件(如質粒)對其造成的干擾。CRISPR因其在結構上的特殊性和在功能上的特異性正逐漸成為細菌研究領域的熱點。[12]在研究CRISPR序列過程中還發現許多與這些序列功能存在關聯的核酸酶或螺旋酶,統稱為CRISPR—相關因子Cas(CRISPR-associated),從而在細菌中鑒定出一個全新的CRISPR-Cas系統。

5.2 CRISPR系統生物學功能和免疫機制的闡明

因缺乏病毒和質粒的序列信息,初期對CRISPR系統的研究進展緩慢,其行使的確切功能一直未能闡明。隨著測序技術和生物信息學的發展,2005年3個研究小組都發現CRISPR的居間序列(spacer)并非細菌自身染色體所擁有,反而和細菌病毒(噬菌體)以及染色體外DNA(質粒)序列更為相似,即與宿主菌的染色體外的遺傳物質高度同源。據此科學家們推測CRISPR-Cas的功能可能與細菌抵抗外源遺傳物質入侵的適應性防御系統(免疫系統)有關：細菌通過特定方式獲取噬菌體DNA片段并將其整合到自身CRISPR序列,從而對外源入侵病毒產生“記憶”,當噬菌體再次感染時,細菌利用這些序列信息來識別入侵者并將其破壞。[13]

2007年法國科學家霍瓦特和巴蘭古小組在研究生產酸奶的乳酸桿菌對噬菌體的抗性時首次發現并證明了細菌可利用CRISPR系統抵抗噬菌體的入侵。[14]他們在研究中發現：感染烈性噬菌體后的細菌大部分死亡,保留下來的“幸運”細菌則獲得對同株噬菌體再次感染的抗性。對這些細菌基因組分析發現其CRISPR居間序列中存在噬菌體序列,去除這些序列可造成細菌噬菌體抗性消失；而將這些序列直接整合到未感染過噬菌體的細菌CRISPR,則細菌對首次噬菌體感染也擁有抗性,從而證實了CRISPR居間序列的重要作用。進一步的研究還發現,細菌獲得抗性的原因在于具有內切酶活性的Cas蛋白可特異性地將與居間序列互補配對的噬菌體DNA雙鏈在特定位置切開,從而造成噬菌體DNA雙鏈斷裂,以消除潛在威脅。[15]他們的突出貢獻是發現了Cas7和Cas9(Cas protein-9 nuclease,一種分子質量很大的多功能蛋白,由crRNAs介導在DNA中產生的DSB。在早期的CRISPR文獻中,如今大名鼎鼎的Cas9曾被稱作Cas5或Csn1)蛋白在CRISPR中的重要作用：Cas7產生間隔和重復序列,Cas9則是內切酶(核酸酶)。通過一系列研究表明CRISPR-Cas是一種全新的細菌獲得性免疫系統,細菌通過該系統可實現自我保護,這一現象的直接用途就是通過改造細菌基因組而獲得抵抗噬菌體能力,減少工程菌死亡,而更為重要的用途則是隨后發明的基因組編輯技術。因CRISPR系統在食品發酵工業和醫學中的巨大潛在價值而使其迅速成為研究熱點。

2008年科學家們又發現細菌CRISPR系統能阻止外源質粒的轉移, 首次利用實驗驗證了CRISPR系統的底物是DNA, 進一步明確了其作用機制, 并意識到它可能被應用于DNA編輯。[16]

CRISPR系統同時具有“搜索”和“摧毀”2種機制：使用遺傳物質RNA來尋找特定序列的DNA,同時使用Cas9中的內切酶來剪接DNA。CRISPR系統介導的免疫機制分為3個階段：獲得(acquisition)、表達(expression)和干擾(interference)。獲得階段又稱信息處理階段,后2個階段又合稱執行階段。

5.3 CRISPR-Cas9基因組編輯技術的發明

卡彭蒂埃的研究重點是感染性疾病分子生物學,她更多地關注細菌抵御病毒侵染的分子機制,CRISPR-Cas系統被發現后,其研究小組迅速投入該研究領域,他們初步闡明CRISPR來源RNA(CRISPR-derived RNA=crRNA)的生成和作用,發現一種反式激活crRNA(trans-activating crRNA=tracrRNA)可與Cas蛋白參與RNA酶Ⅲ,對CRISPR轉錄生成序列的選擇性酶切而產生crRNA,隨后Cas蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復合物可對與crRNA配對的外源DNA實施剪接。[17]杜德娜的主要研究方向是RNA介導基因調節的分子機制,她擁有完美的學術生涯：1989年以核酶(ribozyme)方面的論文《面向RNA復制酶的設計》(TowardsthedesignofanRNAreplicase)獲哈佛大學生物化學PhD,其博導是“因發現端粒酶和端粒保護染色體的機理”而榮獲諾醫獎的哈佛大學醫學院和霍華德·休斯醫學研究所的加拿大和美國(雙重國籍)生物學家紹斯塔克(Jack William Szostak,1952—,2009PM33)；其博士后指導教師則是因“獨立發現RNA的生物催化作用(即核酶)”而榮獲諾化獎的科羅拉多大學的美國生物化學家切赫(Thomas Robert Cech,1947—,1989CH22)。杜德娜的優勢在于擁有堅實的分子生物學、結構生物學和生物化學等研究基礎。2007年杜德娜小組開始研究CRISPR-Cas系統,重點在于闡明Cas酶催化、crRNA形成和靶位DNA雙鏈斷裂過程中的結構基礎和分子機制。[18]

2011年斯克尼斯小組在大腸桿菌中重組了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統,證實該系統的充分必要組分包括Cas9核酸酶、crRNA和tracrRNA。[19]至此細菌獲得性免疫系統CRISPR-Cas的作用機制被基本闡明,CRISPR系統被證實可用作準確和高效的基因組編輯工具,從而為其進一步的實際應用奠定了堅實基礎。CRISPR-Cas發揮作用主要分為3個步驟：①外源DNA部分短序列作為間隔序列插入到細菌染色體DNA而形成CRISPR；②CRISPR轉錄生成crRNA前體,借助RNA酶Ⅲ完成crRNA加工成熟；③crRNA區間序列與外源DNA互補配對啟動Cas蛋白催化的DNA剪接。科學家們在研究中共發現存在3類CRISPR-Cas系統,其中Ⅱ類系統最為簡單,只需要一種Cas蛋白(即Cas9)就可完成DNA的識別和剪接,更適宜于實際操作。

CRISPR-Cas系統與細菌限制—修飾系統的發現和應用過程具有異曲同工之妙。限制—修飾系統是細菌對自身DNA進行修飾(甲基化),對外源DNA則借助限制性內切酶識別(不識別修飾后的自身DNA)和剪接而抵御感染。后來發現也存在3類限制性內切酶,而Ⅱ類內切酶由于識別和剪接在相同位置而被廣泛應用。發現限制性內切酶及其在分子遺傳學方面的應用是1978年諾醫獎的獲獎成果,而利用限制性內切酶首次實現DNA重組則是美國生物化學家保羅·伯格(Paul Berg,1926—,DNA重組技術之父,1980CH31●)榮獲諾化獎的研究成果。

2011年5月卡彭蒂埃和杜德娜在波多黎各召開的美國微生物學會會議上相識,研究方向的一致性和研究內容的互補性使她倆決定強強聯手,密切合作進行細菌CRISPR-Cas系統應用于DNA編輯的深入研究,果然2012年便率先取得重大突破：[20]聯合小組對天然CRISPR-Cas系統在體外進行適當改造(重組),將tracrRNA和crRNA雙組分利用基因工程整合為一條鏈,稱為單鏈介導RNA(single guide RNA=sgRNA)。改造后用于特定DNA編輯技術的CRISPR-Cas9基本原理是：sgRNA與靶位DNA相應序列互補配對可啟動內切酶Cas9的雙鏈剪接活性,Cas9中的HNH核酸酶結構域負責剪接sgRNA互補鏈DNA,RuvC樣結構域則負責剪接非互補鏈DNA。卡彭蒂埃/杜德娜聯合小組在試管內利用II型CRISPR-Cas系統首次實現了目的DNA特定位點的DSB,為CRISPR-Cas系統應用于基因組定點編輯奠定了基礎,開辟了一個全新領域,這項重大突破便成為CRISPR-Cas9技術發明史的一個重要里程碑。實際上斯克尼斯小組稍早一點已取得類似結果,2012年4月6日他們投稿于《細胞》雜志,6天后被拒稿(事后《細胞》雜志編輯部承認此文確實很重要),作者將文稿壓縮后的精煉版于5月21日改投PNAS并被發表。[21]2013年卡彭蒂埃/杜德娜聯合小組進一步利用CRISPR-Cas9技術在細胞內實現DNA精確定位編輯,隨后迅速引發井噴式發展,通過改造還可實現基因表達的激活或抑制調控。[22]

CRISPR-Cas9技術不僅可用于探索生命奧秘，而且其應用領域寬廣，商業前景十分廣闊，包括細胞和動物模型建立、功能基因組篩選(如修改奶牛基因提高產奶量和修改植物基因提高抗蟲性等)、基因轉錄調節表觀調控、細胞基因組活性成像和靶向基因治療等。[23]因其技術本身存在脫靶效應,在臨床應用安全性方面尚待進一步完善和改進,但其強大的作用效果將為單基因甚至多基因遺傳病治療(基因療法)提供全新模式。

5.4 CRISPR-Cas9技術的發明專利權之爭

生命科學領域國際三大知名學術期刊是指美國《細胞》(Cell)、英國《自然》(Nature)和美國《科學》(Science),合稱CNS。2016年1月14日,《細胞》雜志發表麻省理工學院(MIT)教授、博德研究所(Broad Institute,由MIT和哈佛大學合作創辦于2004年)所長、國際基因測序先驅、數學家和遺傳學家埃里克·蘭德(Eric Steven Lander,1957—)關于基因組編輯技術CRISPR發明歷程的綜述文章《CRISPR英雄譜》,重點介紹這一技術發展史上重要節點的科學家群英榜。[24]該文的發表引起軒然大波,在美國生命科學界引發一場激辯,紛爭和異議不斷,業內不少人認為該文有失客觀和公正。

2011年9月16日美國總統奧巴馬簽署對專利法進行全面修訂的《美國發明法案》,其生效日期2013年3月16日是美國專利系統的一個關鍵時間節點。此前,美國專利和商標局(USPTO/PTO)授予發明專利權實施“發明優先”原則,此后則實施“申請(提交)優先”原則。若申請日在2013年3月16日之后,但發明時間早于這一天,發明專利權的歸屬則依照舊規則執行。

博德研究所美籍華裔生物學家張鋒(Zhang Feng,1982—,自述遲至2011年2月尚不知CRISPR為何物)首次使用CRISPR系統實現了對人類和哺乳動物細胞的DNA編輯。[25]同期雜志還發表了1篇得到類似結果的文章,其領銜者(通訊作者)是哈佛大學美國遺傳學家、分子工程師和化學家切奇(George McDonald Church,1954—)。[26]稍后杜德娜小組亦發表類似結果。[27]

近年來,張鋒所在的博德研究所/MIT和杜德娜所在的UCB霍華德·休斯醫學研究所就CRISPR技術的相關專利權歸屬問題展開激烈爭執。2014年4月15日USPTO依照所謂“發明優先”原則將CRISPR技術的首項相關專利權授予博德研究所/MIT的張鋒而不是早于2013年3月15日便提交申請的杜德娜/卡彭蒂埃[28],不少人認為出現這種結果的一個重要的原因就是博德研究所的專利律師申請了快速審查(fast-track patent)而抄了近道。為了支持自己獲取發明專利權,張鋒表示他對杜德娜/卡彭蒂埃小組的工作知之甚少(2011年2月時張鋒對CRISPR技術還一無所知),并提交實驗室筆記本的照片,以證明自己在2012年年初就開始了這方面的研究工作,時間上要早于對方。截至2015年11月,張鋒實驗室和博德研究所關于CRISPR-Cas9技術的相關專利權在美國已有14個獲得授權,在歐洲亦有4個被批準,控制著CRISPR技術的每個重要商業應用。

UCB經精心準備之后,于2015年4月請求USPTO啟動干預程序,重新審核CRISPR技術首項相關專利權的歸屬,此請求已于翌年1月獲得同意,3月10日干預程序正式啟動,這意味著雙方又站在了同一起跑線上,都需要拿出最強有力的證據來證明自己就是CRISPR技術的第一發明人。在啟動重新審核專利權的節骨眼上,深陷發明專利權苦戰的張鋒略顯意外地落選阿獎,這無疑又是一記沉重打擊,很可能為這場爭執埋下不利伏筆甚或是禍根,筆者認為杜德娜/卡彭蒂埃一方翻盤的可能性很大。

5.5 基因組編輯技術的新突破及質疑

CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸酶ZFN(zinc-finger nuclease,2002年首次應用于敲除目的基因)和轉錄激活因子樣效應物核酸酶TALEN(transcription activator-like effector nuclease,2011年成功應用于目標基因的編輯[29])之后問世的第3代人工核酸酶和基因組編輯技術,被譽為基因組編輯的一把“魔剪”。與前兩代技術相比,它具有成本低、制作簡便和快捷高效等優點,因其擁有無可比擬的技術優勢而迅速風靡于世界各地的生命科學實驗室,人類的諸多遺傳性疾病有望通過CRISPR-Cas9技術而得以解決。

2016年5月2日,河北科技大學(石家莊)生物科學與工程學院副教授韓春雨[通訊作者,1974年出生于石家莊,1996年本科畢業于河北師范大學生命科學學院,2000年獲中國農業科學院作物遺傳育種專業碩士學位,2003年獲中國協和醫科大學(2007年起已更名為北京協和醫學院)生物化學與分子生物學ScD。其主要合作者沈嘯系浙江大學醫學院基礎醫學系研究員]小組在國際頂級期刊英國《自然·生物技術》雜志在線發表論文《利用格氏嗜鹽堿桿菌的Argonaute蛋白實現DNA介導的基因組編輯工具》[30],他們另辟蹊徑,利用古細菌——格氏嗜鹽堿桿菌中的一種Argonaute蛋白作為內切酶,采用短鏈單鏈DNA作介導,發明一種對基因組位點編輯范圍更廣更精準的基因組編輯新技術NgAgo-gDNA(NgAgo=Natronobacterium gregoryi Argonaute),它不同于以RNA作介導的CRISPR-Cas9-sgRNA技術,可真正實現對基因組的任意位置進行剪接,將基因組編輯技術的可能性推進到更廣泛的境地,它還規避了令人頭痛的RNA易于形成復雜的二級結構而帶來的失效或脫靶效應,其性能優于當今西方的熱門技術CRISPR-Cas9,該研究成果打破了外國基因組編輯技術的發明專利壟斷,實現了中國尖端生物技術原創零的突破。

2014年2月韓春雨偶然閱讀到荷蘭瓦格寧根大學(Wageningen University)科學家小組在《自然》雜志發表的論文報道TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)可在高溫條件下體外切割DNA(該項成果已申請英美和PCT國際專利)[31]，受此啟發才著手利用Argonaut進行相關課題研究。

2015年12月21日，韓春雨小組的相關研究申請了題為“以Argonaute核酸酶為核心的基因編輯技術”的中國專利(專利權人：浙江大學，發明人：沈嘯、韓春雨，申請號：CN201510971234.5，公開號：CN105483118A，公開日：2016.04.13，國際專利分類IPC號：C12N15/10)，2016年5月11日該專利已進入實質審查階段。該項成果尚未申請包括PCT國際專利在內的國外專利。

2016年6月30日,著名科普作家、學術打假斗士和中國獨立新聞人的先驅方舟子先生(原名方是民,1990年獲中國科學技術大學生物系BSc,1995年獲美國密歇根州立大學生物化學PhD,曾先后在美國羅切斯特大學生物系和索爾克生物研究院做博士后研究,研究方向是分子遺傳學)在網絡上公開發文質疑韓春雨小組所謂“諾貝爾獎級”實驗成果存在“不可重復性操作”問題,懷疑該科研成果的可靠性和真實性。[32]國內外實驗室的科學家們甚至無法檢測出NgAgo的內切酶活性,還有人擔心韓春雨小組是否故意隱瞞了一些數據,把偶然現象當作了一種常態(即科研上的所謂假陽性結果)。

韓春雨小組論文所稱可有效編輯內源性基因組的研究成果發表以后，在該領域影響很大，因NgAgo基因組編輯技術的實驗始終無法重復，國內外有關專家學者紛紛提出質疑，2016年11月11日南通大學劉東小組在英文期刊《細胞研究》(中國科學院上海生命科學研究院主辦)以“致編輯信”(Letter)形式在線發表《基于NgAgo的fabp11a基因敲低引起的斑馬魚眼睛發育缺陷》一文，提出NgAgo系統無法用于編輯斑馬魚基因組。[33]同年11月15日中外20名專家學者聯名在英文期刊《蛋白質與細胞》(由中國科學院北京生命科學研究院、中國生物物理學會和高等教育出版社聯合創辦)以Letter形式在線發表《有關NgAgo的問題》一文，反映各自所在的研究小組均無法重現韓春雨小組在NgAgo論文中所述及的結果，呼吁原始論文的作者澄清NgAgo技術的不確定性。[34]緊接著，11月28日刊載韓春雨小組論文的原始期刊《自然·生物技術》以“編輯部關注”(To the Editor)形式在線發表韓德美3個獨立團隊10名主流科學家聯名的通信論文《利用NgAgo未能檢測到DNA引導的基因組編輯》[35]，他們都無法重復韓春雨小組原論文中圖4的結果，這一關鍵圖表展示了對哺乳動物細胞內源性基因位點的編輯。這些團隊無一能在任何位點，或在任何高于檢測方法敏感度的條件下觀察到NgAgo所誘導的變異，未能檢測到成功編輯靶向序列的證據。

NgAgo-gDNA新技術具有編輯對象受限更小、介導設計制作簡便、特異性高和脫靶率低等明顯優勢,盡管該技術尚處于初級階段，但它能否如愿發揮出其優勢和潛力,蓬勃興起并迅速占領市場,從而擔當起第4代基因組編輯技術之重任,最終取代一度席卷全球的CRISPR-Cas9技術抑或與其并駕齊驅,人們現只能拭目以待,此事尚需等待時間的檢驗。

6 結束語

現代醫學是循證醫學EBM(又稱實證醫學、證據醫學,evidence-based medicine),意即“遵循證據的醫學”,其核心思想是醫療決策(即病人的處理、治療指南和醫療政策的制定等)應在現有的最好的臨床研究依據基礎上作出,同時也重視結合醫生個人的臨床經驗。循證醫學不同于以經驗醫學為主的傳統醫學。

中國工程院院士樊代明先生認為人類醫學經歷了經驗醫學時代、科學醫學(或稱生物醫學)時代,現在則是整合醫學時代。整合醫學HIM(holistic integrative medicine)是把全科醫學、轉化醫學(translational medicine)、循證醫學和互補醫學(即補充和替代醫學,包括世界各地的傳統醫學和民間療法,如印度醫學、催眠療法、傳統的中醫藥和針灸療法等)等精髓加以整理整合而成,使之適應、符合病人的全身整體治療,它與整體醫學(holistic medicine,有學者認為它是循證醫學和補充醫學的結合)亦有所不同。整合醫學作為新的醫學體系,是未來醫學發展的必然方向和必由之路。[36～37]

屠呦呦先生因發現青蒿素和雙氫青蒿素的重大原創性貢獻,于2011年和2015年先后摘取拉斯克臨床醫學研究獎和沃倫·阿爾波特基金獎,這為她稍后贏取諾醫獎(2015PM31●)奠定了堅實基礎。屠呦呦接連斬獲3項世界級大獎,從而鎖定了她在醫學科學界的“青蒿素之母”的崇高地位,也使得頗受關注的青蒿素發現發明權之爭終于塵埃落定。鑒此筆者認為,在不久的將來屠呦呦先生將眾望所歸地登頂成為國家最高科學技術獎得主。

去年學界失湯斯(Charles Hard Townes,1915.07.28—2015.01.27),今年吾家逝慈父。家父朱堯天先生(譜名：在昭,筆名：牧夫,1934.11.13今湖南省邵東縣—2016.08.03深圳市龍華新區)已駕鶴西歸,特謹致無限的深情哀思。對于飛秒化學之父(Father of femtochemistry)、埃及和美國(雙重國籍)物理化學家和化學物理學家澤維爾(Ahmed Hassan Zewail,1946.02.26埃及Damanhur—2016.08.02加利福尼亞州帕薩迪納市,1999CH,埃及歷史上迄今唯一的諾貝爾科學獎得主,諾獎歷史上的第580位逝者)以及美籍華裔生物化學家錢永健先生(Roger Yonchien Tsien,1952.02.01紐約州紐約市—2016.08.24俄勒岡州尤金市,2008CH33,錢學森先生的堂侄,首位逝世的華裔諾獎得主,諾獎歷史上的第582位逝者)的不幸仙逝,特順致深切哀悼。截至2016年9月底,已逝諾獎得主逝世于8月份者為最多(64/584人),逝世于11月份者為最少(38/584人),均值是48.67±7.95人,僅2016年8月全世界就損失4位諾獎得主,痛乎矣!悲乎哉!!

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