鴨疫里氏桿菌對氟苯尼考耐藥性的研究

姜　丹　彭曉宇　山東省榮成市嶗山畜牧獸醫站264300

孫麗麗　山東省榮成市蔭子畜牧獸醫站264300

鴨疫里氏桿菌對氟苯尼考耐藥性的研究

姜丹彭曉宇山東省榮成市嶗山畜牧獸醫站264300

孫麗麗山東省榮成市蔭子畜牧獸醫站264300

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌感染而致，又稱鴨傳染性漿膜炎，是一種主要侵害雛鴨的接觸性傳染病，臨床特點是困倦、厭食、眼和鼻孔有分泌物、下痢、共濟失調和抽搐，是目前養鴨業中最為嚴重的細菌性傳染病之一。本實驗測定了10種常用抗菌藥對8株鴨疫里氏桿菌的敏感性。結果表明，對頭孢曲松鈉和硫氰酸紅霉素的耐藥率達100％；其次為慶大霉素和頭孢喹諾，耐藥率為87.5％；而對氟苯尼考的耐藥率為50％。

鴨疫里氏桿菌；氟苯尼考；耐藥機制

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類共患的一種急性或慢性、接觸性傳染病［1］，又稱為鴨傳染性漿膜炎。鴨疫里氏桿菌對多種抗菌素極易產生耐藥性，治療時應根據藥敏試驗結果選用敏感藥物。鴨疫里氏桿菌一般對氟苯尼考、恩諾沙星、環丙沙星、新霉素、土霉素和鹽酸林可霉素均較敏感，而對青霉索、鏈霉素、磺胺六甲氧嘧啶不敏感［2］。

1　實驗材料

（1）鴨疫里氏桿菌菌株來源。某鴨疫里氏桿菌病發病鴨場臨床分離的8株鴨疫里氏桿菌。

（2）藥品。氟苯尼考（含量為90％，批號040301，江西博萊大藥廠），左氧氟沙星（含量：90.5％，批號：200611038639，岳陽同聯藥業），頭孢曲松鈉（批號：20090101，山東魯抗醫藥股份有限公司），頭孢喹諾（含量：中國獸藥監察所），硫氰酸紅霉素（效價：783.4U/mg，批號：200709120，岳陽同聯藥業），硫酸慶大霉素（批號：GENTAMYCIN1005081，邯鄲市第二制藥廠），恩諾沙星（含量：98.5％，批號：NA00N100108-A，浙江新華藥廠），鹽酸環丙沙星（批號：060630-7，浙江國邦藥廠），阿莫西林（含量：99％，批號：08060507，華北制藥集團先泰藥業有限公司），磺胺嘧啶（含量：99.45％，批號：080335，昆山雙鶴藥業）。

（3）各種試劑。LB培養基、酵母浸出物、水解酪蛋白為Oxoid產品。固體培養平板為LB液體培養基加入1.6％瓊脂，分裝平皿后滅菌。生化微量鑒定管，杭州天和微生物試劑有限公司出品。瓊脂糖淀粉購于Oxoid公司，TAE緩沖液、Golden view核酸染料試劑購于原平皓生物公司（1009081）。

2　實驗方法

（1）鴨疫里氏桿菌細菌的培養與生化試驗鑒定。菌株復蘇、活化、傳代。用接種環蘸取凍存于-20℃條件下的RA甘油菌少許，劃線接種于瓊脂LB平板上，倒置于溫箱中，37℃下培養24小時。待平板上長出單個菌落，挑取形態均一的單個菌落，接種于含3mL LB的試管中，37℃下振蕩培養12～16小時，待菌株生長，再傳代接種于LB培養基中，多次傳代至0.5～0.6個麥氏比濁濃度。37℃恒溫保存，備用。

按常規方法進行糖發酵試驗、靛基質試驗、硫化氫試驗、VP、枸櫞酸試驗等生化特性試驗［3］。

（2）臨床分離鴨疫里氏桿菌對指示藥物的敏感性試驗。純培養好的菌液使用前稀釋1000倍。采用CLSI推薦的微量稀釋法測定各藥對細菌的MIC［4］。將細菌接種于LB培養基中，37℃溫箱培養過夜，使細菌濁度達到9×108個/mL，取無菌96孔培養板，將上述菌液作1∶1000倍稀釋，除第1孔加入稀釋菌180μL外，其余的各孔均加入100μL。繼之于第1孔加入抗生素原液20μL（320μg/ml）充分混合后吸出100μL加入第2孔中，按同法稀釋至第11孔，棄去100μL，第11孔為細菌對照，第12孔為培養基對照。將培養板37℃下培養16～24小時，觀察結果。凡藥物最高稀釋孔中無細菌生長者，該孔的濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

3　結果與分析

（1）細菌培養、細菌生化試驗結果。菌株接種LB板，經37℃培養24～48小時后，為光滑、微突起、透明、奶油狀、直徑為l.0mm～2.0mm的菌落，04#菌株直徑較小并呈雙排排列。在半固體瓊脂培養基上沿穿刺線上生長，沒有發現該細菌具有運動性。糖發酵、靛基質、V-P、枸椽酸鹽、尿素酶和硫化氫試驗（表1），符合鴨疫里氏桿菌的生化特性［5］。

（2）MIC的測定。結果根據CLSI（2008）中10種藥物MIC標準進行判定，分離得到的8株鴨疫里氏桿菌，其中氟苯尼考耐藥率為50％，阿莫西林耐藥率為25％，頭孢噻呋耐藥率為37.5％，頭孢喹諾耐藥率為87.5％，頭孢曲松鈉耐藥率為100％，左氧氟沙星耐藥率為12.5％，環丙沙星耐藥率為25％，恩諾沙星耐藥率為25％，慶大霉素耐藥率為87.5％，硫氰酸紅霉素耐藥率為100％。其中有兩株菌株10.09.02 04#和10.09.14 06#菌對氟苯尼考、頭孢喹諾、頭孢曲松鈉、慶大霉素和硫氰酸紅霉素呈高度耐藥，其最小抑菌濃度（MIC）值均≥128μg/mL。其它藥物對這兩株菌的最小抑菌濃度差異性較大。

4　討論

（1）鴨疫里氏桿菌生化反應。本試驗共研究鴨疫里氏桿菌2株，采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉水解、靛基質、H2S、明膠、甘露醇、vp等生化反應對其進行鑒定。經多次鑒定試驗，發現兩株菌株除葡萄糖和蔗糖發酵鑒定結果與文獻報道不符，其他生化反應均一致。這種生化反應的異同可能是由于受到環境中溫度、濕度、紫外線等各種理化因素變化的影響，在動物體內則是受到各種細胞因子、抗生素的選擇性壓力的影響，從而造成細菌發生基因突變，使某些生化反應不穩定，容易出現假陽性和假陰性的結果［6］。

（2）藥物敏感性。鴨疫里氏桿菌對β-內酰胺類抗生素如阿莫西林、氨芐西林、亞胺培南、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢吡肟的敏感性較高，其中亞胺培南、頭孢吡肟抗菌活性最高，它們對所有菌株的最小抑菌濃度（MIC）值較低［7］。頭孢吡肟主要抑制細胞壁肽多糖的形成，通過抑制細菌細胞壁的合成而產生殺菌作用，能耐受多種β—內酰胺酶的破壞，因此抗菌活性較高。

鴨疫里氏桿菌對氟喹諾酮類藥物環丙沙星敏感，其MIC值均≤32μ/mL。氟喹諾酮類藥物（FQs）具有抗菌譜廣、臨床療效好及可多途徑給藥的優點，在臨床實踐應用中與其他抗生素無交叉耐藥性。鴨疫里氏桿菌對氨基糖苷類藥物阿米卡星、慶大霉素也較敏感，氨基糖苷類藥物具有抗菌譜廣性質穩定及水溶性好等優點。四環素類藥物多西環素對鴨疫里氏桿菌的MIC值均≤16μ/mL。該類藥物具有內服吸收迅速、生物利用度高及組織滲透力強等優點。其它藥物由于菌株之間的差異性和不同地區用藥不同而表現出不同的敏感性。鴨疫里氏桿菌很容易產生耐藥性，殺滅此菌可根據藥敏試驗選用敏感藥物。藥物治療短期內有一定效果，但連續使用很快就會產生耐藥性。因此每次用藥前均需進行藥敏試驗以確定首選藥物，也可采用聯合用藥方式，提高治療效果。

［1］Calnek B W．禽病學［J］．第9版．高福，劉文軍，主譯．第lO版，北京：北京農業大學出版社，1991．153-l57．

［2］陳金敏，王秀麗，李文義，等.雛鴨傳染性漿膜炎的診斷與防制［J］.養殖與飼料，2007（03）：39．

［3］張大丙，郭玉璞．不同血清型鴨疫里氏桿菌分離株的生化特性比較［J］．中國獸醫雜志，1999，2（5）：13-15．

［4］Performance standards for antimiarobial susceptibility testing eighteenth informational supplement.CLSI document MI00一S18［S］．Wayne，Pennsylvania，Cinical and Laboratory Standards lnstitute，2008，28（1）：1-83．

［5］劉偉華，趙艷麗，王玉海，等．鴨疫里默氏菌研究進展［J］．動物醫學進展，2008，29（5）；91-93．