白假絲酵母菌生物膜的形成及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

劉林波，李亞婷 綜述,郭瑞林 審校

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)：1.醫(yī)學(xué)技術(shù)系；2.第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000)

·綜述·

白假絲酵母菌生物膜的形成及耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

劉林波1，李亞婷1綜述,郭瑞林2△審校

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)：1.醫(yī)學(xué)技術(shù)系；2.第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000)

關(guān)鍵詞:白假絲酵母菌；生物膜；耐藥機(jī)制

1976年Marshall第一次提出了生物膜的概念 ，指出“生物膜是生長(zhǎng)于細(xì)菌表面非常細(xì)的外聚合物纖維”。時(shí)至今日，人們對(duì)生物膜的研究取得了新的進(jìn)展和認(rèn)識(shí)，新的定義指出生物膜是微生物群落為了自我保護(hù)而產(chǎn)生的一種附著于組織表面、由其自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包裹的細(xì)胞菌群的一種形態(tài)。自然界中微生物主要是以生物膜的形式存在，65%～80%的人類(lèi)感染性疾病與生物膜相關(guān)[2]。臨床上生物膜廣泛存在于各種介入性醫(yī)學(xué)材料表面，諸如支架、分流器、氣管內(nèi)插管、起搏器、其他植入物等。調(diào)查顯示60%的ICU患者患有的生物膜相關(guān)感染均由使用導(dǎo)管引起[3]，其中白假絲酵母菌是導(dǎo)管相關(guān)感染的第三大原因，占總感染率的第2位，病死率的第1位[4]。因此，對(duì)白假絲酵母菌生物膜的形成及其相關(guān)基因、耐藥機(jī)制以及預(yù)防與治療的研究非常重要。

1白假絲酵母菌生物膜的形成及其相關(guān)基因

1.1白假絲酵母菌生物膜在體外形成的4個(gè)階段白假絲酵母菌生物膜在體外形成大致可以分為4個(gè)階段：(1)以酵母細(xì)胞形式黏附于各種介質(zhì)表面；(2)酵母細(xì)胞沿介質(zhì)表面生長(zhǎng)增殖形成一層基底層細(xì)胞；(3)酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相，大量菌絲的生長(zhǎng)伴隨著細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生，逐漸形成成熟的生物膜；(4)脫落的酵母細(xì)胞作為種子傳播，形成新的生物膜。ECM作為生物膜重要的組成部分，為細(xì)胞的聚集和黏附提供一個(gè)支架并維持生物膜的結(jié)構(gòu)，同時(shí)也是細(xì)胞吸收水分和營(yíng)養(yǎng)的必經(jīng)通道。組成ECM的主要大分子物質(zhì)有：55%的蛋白質(zhì)、25%的碳水化合物、15%的脂質(zhì)和5%的核酸。其中碳水化合物主要包含3種多糖：(1,6)-甘露聚糖占87%、(1,6)-葡聚糖約13%、而(1,3)-葡聚糖只占很小一部分，脂質(zhì)中中性甘油糖脂占89.1%、極性甘油糖脂10.4%、鞘脂類(lèi)0.5%[6]。

體外研究表明，影響白假絲酵母菌生物膜形成常見(jiàn)的因素有(1)血清、溫度、pH值、CO2的影響：加入血清和升高溫度(37 ℃)可以促進(jìn)其菌絲的生長(zhǎng)；當(dāng)環(huán)境pH>6.5時(shí)可發(fā)生酵母相到菌絲相的轉(zhuǎn)變；5%的CO2對(duì)菌絲生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用[7]。(2)培養(yǎng)基的影響：比較RPMI-1640培養(yǎng)基和YNB(無(wú)氨基酵母氮源)培養(yǎng)基對(duì)白假絲酵母菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)生物膜在RPMI-1640中生長(zhǎng)較厚，而在YNB中僅表現(xiàn)為粘連，不能形成多層結(jié)構(gòu)的生物膜[8]。(3)氨基酸代謝：脯氨酸和蛋氨酸與G耦聯(lián)蛋白受體GPR1結(jié)合激活cAMP-PKA途徑，促進(jìn)其由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變[9]。(4)附著層材料的影響：Hawser等[10]比較不同導(dǎo)管材料對(duì)白假絲酵母菌生物膜形成的影響發(fā)現(xiàn)，乳膠和硅酮彈性體相比聚氯乙烯(PVC)上形成的生物膜略有增加，而在聚氨酯和100%的硅膠上形成的生物膜顯著下降，即使是同一種材料不同廠家也會(huì)有差別。(5)群體感應(yīng)系統(tǒng)也會(huì)影響生物膜的形成：法尼醇是真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)群體感應(yīng)分子，它可以抑制白假絲酵母菌由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變，但法尼醇的存在會(huì)影響T細(xì)胞的增殖，造成真菌的細(xì)胞免疫逃逸[11]，因此法尼醇對(duì)機(jī)體的作用具有兩重性。

1.2白假絲酵母菌生物膜形成相關(guān)基因白假絲酵母菌為雙相菌，正常情況下一般為酵母相，致病時(shí)轉(zhuǎn)化為菌絲相。其生物膜形成最重要的毒力因子就是黏附宿主細(xì)胞和菌絲的形成。在黏附宿主細(xì)胞的過(guò)程中不同時(shí)間段表達(dá)的黏附因子不同，誘導(dǎo)早期生物膜形成的黏附因子有ALS1、ALS2、ALS3、ALS4、EAP1、MSB2、PGA6、SIM1、ORF19.2449和ORF19.5126，其中PGA6、ORF19.5126、ALS4、ALS2、SIM1、EAP1和ALS1與浮游菌相比表達(dá)增加，說(shuō)明細(xì)胞的黏附需要這7個(gè)基因[12]。在菌絲形成的過(guò)程中，UME6起到了重要作用，它可以增加白假絲酵母菌菌絲的生長(zhǎng)，促進(jìn)其生物膜的形成[13]。

還有一些基因不是直接控制細(xì)胞形態(tài)變化，而是控制一組目標(biāo)基因間接的執(zhí)行特定的功能。該類(lèi)型的基因目前發(fā)現(xiàn)的主要有6個(gè)，分別是BCR1、EFG1、NDT80、ROB1、TEC1、BRG1。其中每個(gè)基因?qū)ζ渌?個(gè)基因都有控制作用，形成一個(gè)巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并間接控制了大約1 000個(gè)基因[14]。研究表明，BCR1 通過(guò)調(diào)控ALS3的過(guò)表達(dá)從而促進(jìn)生物膜在體外、體內(nèi)的形成。在體外，若BCR1/BCR1突變則無(wú)法形成生物膜，但人為增加ALS3表達(dá)依然可以形成生物膜；若ALS3/ALS3突變則不能形成生物膜。而在體內(nèi)，這種單純的調(diào)控略有不同，體內(nèi)存在代償途徑，若BCR1/BCR1突變，不能使ALS3過(guò)表達(dá)，但會(huì)有ALS1、ECE1、HWP1代償性表達(dá)，最終形成生物膜[15]。然而，這6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子并不是對(duì)所有酵母菌都有相同的調(diào)控作用，如NDT80可調(diào)控白假絲酵母菌生物膜的形成，但對(duì)釀酒酵母菌只調(diào)節(jié)其減數(shù)分裂[16]。

2白假絲酵母菌生物膜的耐藥機(jī)制

眾所周知，形成生物膜的真菌耐藥性明顯增加，而要清除成熟的生物膜非常困難。它的耐藥模式不排除傳統(tǒng)耐藥模式如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、個(gè)體細(xì)胞基因突變等，但也有其獨(dú)特的耐藥機(jī)制。目前認(rèn)為主要有以下3種：ECM延緩藥物的滲透；細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)；耐藥基因的出現(xiàn)。

2.1ECM延緩藥物的滲透藥物進(jìn)入被生物膜包裹的細(xì)胞要通過(guò)其形成的ECM，它可以延緩某些藥物的擴(kuò)散，Suci等[17]發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌生物膜可延緩環(huán)丙沙星的滲透，未形成生物膜的表面只需要40 s就可以滲透，而滲透成熟的生物膜需要21 min。白假絲酵母菌生物膜也有相似的阻礙作用[18]。然而，不是所有的藥物都會(huì)出現(xiàn)滲透限制現(xiàn)象，如糖肽類(lèi)萬(wàn)古霉素和替考拉寧會(huì)受到顯著的影響，而利福平、克林霉素和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)不會(huì)受到影響或影響較小，這說(shuō)明ECM對(duì)藥物的滲透與藥物的種類(lèi)有關(guān)。大量研究表明，ECM 的這種抗藥性可能與生物膜在形成過(guò)程中分泌的葡聚糖有關(guān)，其中(1,3)-葡聚糖可隔離氟康唑等進(jìn)入生物膜[19]。

2.2細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)白色念珠菌屬于條件致病菌，當(dāng)它感受到生存環(huán)境的變化刺激、傳導(dǎo)刺激信號(hào)(如溫度、pH等)時(shí)，就會(huì)由酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相生長(zhǎng)，而在這個(gè)過(guò)程中鈣調(diào)磷酸酶對(duì)其刺激信號(hào)的傳遞起到了至關(guān)重要的作用，也就是說(shuō)鈣調(diào)磷酸酶能讓細(xì)胞更好的適應(yīng)生存環(huán)境。缺乏鈣調(diào)磷酸酶的突變株對(duì)氟康唑明顯敏感[20]。

2.3耐藥基因形成生物膜的真菌其耐藥相關(guān)的主要基因是編碼多種藥物外排泵的基因和細(xì)胞外基質(zhì)DNA(eDNA)。目前已確定的2種編碼多種藥物外排泵的轉(zhuǎn)運(yùn)因子，即ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC)編碼的CDR基因(CDR1和CDR2)和易化擴(kuò)散載體超家族中的多耐藥基因MDR1，這兩種基因在白假絲酵母菌生物膜的形成過(guò)程中表達(dá)增加[21]。另外，ECM是白假絲酵母菌生物膜的形成及其耐藥的重要原因之一，而eDNA是組成ECM的DNA，它對(duì)維持生物膜的完整性至關(guān)重要，減少eDNA可以破壞生物膜的構(gòu)架；相反，添加外源性的eDNA可以促進(jìn)生物膜的生長(zhǎng)[22]。總之，生物膜的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。

3白假絲酵母菌生物膜相關(guān)感染的預(yù)防與治療

形成生物膜的真菌具有很強(qiáng)的耐藥性和免疫逃逸性，導(dǎo)致許多難治性感染。最近有研究顯示，兩性霉素B和棘白菌素(卡泊芬凈和米卡芬凈)對(duì)白假絲酵母菌生物膜有著獨(dú)特的敏感性，且與法尼醇聯(lián)合作用有更好的效果 。而大劑量的氟康唑與卡泊芬凈聯(lián)合會(huì)有拮抗作用[24]，有趣的是，高濃度的氟康唑作用于白假絲酵母菌生物膜后再用卡泊芬凈，會(huì)導(dǎo)致卡泊芬凈的功效顯著減低，這可能與高濃度氟康唑介導(dǎo)的Hsp90和鈣調(diào)磷酸酶產(chǎn)生的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[25]。此外，Taff等[26]發(fā)現(xiàn)3種葡聚糖修飾酶(BGL2、PHR1、XOG1)對(duì)(1,3)-葡聚糖的分泌和胞外基質(zhì)的形成很重要，缺乏這些修飾酶的基因突變體形成的ECM中葡聚糖含量降低且ECM形成的量減少，對(duì)氟康唑的敏感性明顯增強(qiáng)，因此，這幾種葡聚糖修飾酶的抑制劑可能會(huì)成為抗真菌藥物的新靶點(diǎn)。

除了藥物的治療，尋找預(yù)防白假絲酵母菌生物膜形成的導(dǎo)管性材料也是一條有效的途徑。近年發(fā)現(xiàn)聚乙烯亞胺(PEI)和聚乙烯胺為基礎(chǔ)的納米粒子(nanoPEI)可抑制細(xì)菌和酵母菌生物膜的形成[27]；Anna等[28]使用中心靜脈導(dǎo)管(CVC)插管的小鼠，將卡泊芬凈滴入CVC作為預(yù)防體內(nèi)白假絲酵母菌生物膜的新型模型，證明該模型能顯著減少生物膜的形成；與此同時(shí)，Silva-Dias等[29]發(fā)現(xiàn)將硝酸鈰(鈰為鑭系元素)作為醫(yī)療導(dǎo)管內(nèi)涂層，能夠有效地防止生物膜相關(guān)感染的形成。

目前對(duì)白假絲酵母菌生物膜的形成過(guò)程已逐漸明了，多種生物膜形成的相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，多種耐藥機(jī)制與生物膜的形成有關(guān)，但是具體耐藥機(jī)制尚不清楚。傳統(tǒng)的抗真菌藥物已不能滿足治療產(chǎn)生物膜真菌引起的感染，所以，研究生物膜的形成以及它的相關(guān)的基因、耐藥機(jī)制對(duì)研發(fā)新的抗真菌治療靶點(diǎn)具有非常重要的意義。

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DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.033

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)10-1382-04

(收稿日期：2015-12-07)

作者簡(jiǎn)介：疏義林，男，檢驗(yàn)師，主要從事微生物分子診斷方向的研究。△通訊作者，E-mail：sjhongpei@163.com。