南藥青天葵資源和分子生物學研究進展

陳秀珍，何瑞，詹若挺

（廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術研究中心南藥研發實驗室，廣東廣州　510006）

?

南藥青天葵資源和分子生物學研究進展

陳秀珍，何瑞，詹若挺

（廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術研究中心南藥研發實驗室，廣東廣州510006）

摘要：對青天葵資源和分子生物學研究進展進行綜述。近年來青天葵資源和分子生物學的研究涉及青天葵原植物與生藥學鑒定、人工栽培和組織培養、分子鑒定及功能基因等方面，這些技術研究內容主要包括青天葵多倍體培養、分子鑒定、遺傳多樣性、轉錄組特征及功能基因克隆等。應用現代分子生物學技術已實現了青天葵及其近緣種、混偽品的分子鑒定，全面揭示了其遺傳多樣性及品種間的親緣關系；通過構建青天葵轉錄組數據庫，促進了對該植物的生長發育和代謝調控等相關功能基因的研究。近年來青天葵資源和分子生物學研究雖已取得一定成果，但尚未能真正解決青天葵資源匱乏的關鍵問題。今后可利用青天葵轉錄組數據及其基因資源，大規模挖掘基因信息，深入研究候選基因的功能，明確青天葵生長發育過程中的基因調控網絡，利用基因工程手段保護青天葵的種質資源和促進種質資源開發進程。

關鍵詞：青天葵；生藥鑒定；組織培養；人工栽培；分子鑒定；功能基因；文獻綜述

青天葵為蘭科芋蘭屬多年生宿根植物毛唇芋蘭Nervilia fordii（Hance）Schltr.的球莖或全草，又名獨角蓮、鐵帽子、獨葉蓮、珍珠草等，最早記載于《本草綱目拾遺》，為廣東、廣西的特產藥材，更是我國出口創匯的主要藥材［1-2］。青天葵藥性寒涼，味甘苦，無毒，具有清熱解毒、消腫散結、潤肺止咳等功效，對急性支氣管炎、哮喘等肺系疾病的臨床療效顯著，目前已在中藥化學和藥理學等方面取得較大進展［3-8］。近年來，由于過度采挖及其自身生長、繁育特性等原因，青天葵野生資源臨近枯竭，產量難以滿足需求，已被列入中國物種紅色名錄。為深入研究該瀕危物種的生長發育、代謝調控等分子機理，以豐富種質資源開發、利用與保護的途徑，已有學者開展了相關研究。以下綜述青天葵資源和分子生物學方面的研究進展，以期對青天葵種質資源研究的現狀做出合理的評價。

1　原植物及生藥鑒定研究

由于青天葵資源稀少、價格高，臨床需求量又非常大，市場混偽品時常可見。早在20世紀90年代就有學者關注青天葵混偽品的鑒別研究，致力于規范藥材的來源，保證市場藥材的質量，確保青天葵臨床應用的安全有效。

1992年，龐耀鏡等［9］總結了青天葵原植物特殊的葉脈和根狀莖特征。青天葵葉脈具有特殊排列，于葉表面與葉背面交錯隆起，數量大約各占一半，其葉背面正中葉脈直伸葉端，而葉表面的葉脈沿葉端兩側順次排列，隆起的葉脈于葉面呈灰白色翅膜狀。該課題組觀察發現青天葵葉片可長出一段略膨大并生有不定根的植物器官，位于葉柄基部之下、肉質塊莖之上，認為該部位為青天葵地下莖的組成部分。之后，廖月葵等［10］建立了“葉形態—羽狀脈序—脈序圖譜鑒別法”，可以有效地鑒別青天葵及其易淆品番薯葉。中國芋蘭屬植物有7種2變種，產于廣東北部的毛葉芋蘭Nervilia aragoana Gaud.資源較為豐富，形態、功效與青天葵較為相似，傳統也作青天葵藥材用，稱“毛葉青天葵”以區分。毛葉芋蘭與毛唇芋蘭的不同點在于其紫綠色的葉表面和粗脈上均散生粗毛，葉背面呈深紫紅色［11］。

青天葵藥材性狀因加工方式不同而有所差異，干燥葉片青綠色或黃綠色，有的呈帶葉柄的皺縮團粒，有的呈不規則皺縮狀，有的則呈卷縮狀，易于混入偽品。陳鵬仙等［12-15］從藥材性狀特征、顯微特征、理化特征和粉末特征等方面，將青天葵藥材與毛葉芋蘭、紅薯葉、積雪草、滿天星和水半夏等混偽品種進行了區別。

2　組織培養與人工栽培研究

青天葵種子無胚乳，一般以球莖進行無性繁殖，繁殖系數極低。該植物僅適宜生長于石灰巖地區蔭蔽、潮濕的環境，資源分布零星，加上近年亂采濫挖，以全株入藥，導致野生資源日益枯竭，已被列入瀕危植物名錄［16］。為了保護和擴大青天葵種質資源，不少學者開展了青天葵人工栽培和組織培養技術的研究。

早在1985年，鄧錫青等［17］首次實現了以組織培養的方式繁殖子塊莖，先以塊莖為外植體誘導形成根狀莖，擴繁后用根莖形成子塊莖，提高了繁殖系數，且不受季節限制。何芙裳等［18］優化了青天葵的組培條件，以球莖為外植體誘導形成根莖，繁殖后將帶有莖尖的部分埋入砂土中，可形成子球莖及完整植株。凌征柱的課題組［19-22］研究了青天葵快速繁殖及叢生苗誘導的條件，進行了栽培試驗，并對試管苗與野生苗的形態特征，及對引種與組織培養栽培苗的可溶性蛋白進行了比較分析。杜勤等［23-25］對球莖、葉柄、葉片和走莖等外植體誘導效果進行了比較研究，發現以球莖誘導效果較佳，但是以球莖作為外植體需要破環整個植株，不利于資源的持續利用。

之后還有不少以球莖誘導產生再生苗的研究［26-29］，僅潘學峰等［30］報道以青天葵葉片誘導獲得了球莖和再生苗；杜勤等［31-32］建立了青天葵種子無菌萌發的條件，以及用根狀莖再生的球莖制作萌發率較高的青天葵人工種子的方法。張曉麗等［33-35］還進行了青天葵愈傷組織懸浮培養和葉片原生質體分離等研究；程鳳麗［36］成功獲得青天葵多倍體誘導，豐富了青天葵種質資源研究。

近年來也有一些關于青天葵人工栽培的研究，1994年徐乃良［37-38］報道了青天葵的高產栽培技術，對青天葵的生長習性、選地整地、繁殖、種植、田間管理、病蟲害防治及采收加工等方法進行了詳細的介紹。野生青天葵中可以自然開花結果的植株甚少，凌征柱等［39］觀察了青天葵的開花習性，對其人工授粉技術進行了研究。發現青天葵球莖越大越容易產生花芽，所以人工栽培過程中仿野生環境，使用疏松肥沃的土壤進行栽培可促進球莖的生長，獲得較大的球莖，增加產生花芽的概率。在開花后第2天早晨9點至10點進行人工授粉，可促進青天葵開花得到果實。

杜勤［40］對青天葵的人工種植的生長狀況進行了調查監測，制訂了青天葵藥材的質量標準和規范化生產標準操作規程（SOP）。唐美瓊等［41-42］探索了青天葵無土栽培的基質及營養液配方，發現效果較好的基質為菇渣∶木糠∶蔗渣，配比為1∶1∶1，青天葵生長最適合的營養液是1/2劑量萵苣營養液配方，為青天葵人工栽培新模式提供依據。翟勇進等［43］考察了噴施蕓苔素、細胞分裂素和植物基因活化劑3種葉面肥對青天葵器官生長的影響，認為噴施蕓苔素葉面肥可以有效提高青天葵的產量。

3　青天葵的分子鑒定

傳統的中藥品種鑒定的依據主要來自于形態學特征，但該方法存在著重復性和穩定性稍差等缺點。隨著分子生物學的不斷發展，各種分子鑒定技術已經廣泛應用于各種物種的鑒定。目前，隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）、簡單重復序列區間（inter-simple sequence repeats，ISSR）和DNA條形碼（DNA barcode）等已應用于青天葵分子鑒定。

朱華等［44］應用RAPD分子標記技術對來源于同一產地的青天葵和毛葉青天葵進行了種間遺傳多樣性分析，結果表明兩者之間的親緣關系較近，根據兩者RAPD的多態性程度可加以鑒別。而杜勤和魏智強等［45-46］應用RAPD的方法分析了野生種、栽培種、近緣野生種等不同來源青天葵的分子遺傳多樣性，結合其形態可進行鑒別，同時認為青天葵的遺傳多樣性主要來源于地域及生態環境的差異。

黃瓊林等［47-49］采用基于DNA條形碼鑒別技術對青天葵及其混偽品的鑒別作了深入研究，對大葉、中葉和小葉3種葉型青天葵及毛葉芋蘭、紅薯葉、車前草、積雪草等混偽品種的ITS2、rbcL、matK條形碼序列信息的分析表明，基于這3條序列的遺傳距離分析和構建的NJ聚類樹均能直觀地區別青天葵及其混偽品種；應用matK序列完全鑒別了供試的7個物種，并構建系統發育樹展示了7種芋蘭屬物種的親緣關系。周雨晴等［50］采用正交實驗設計優化并建立了穩定可靠的青天葵ISSRPCR反應體系，為青天葵的分子鑒定、遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種、遺傳圖譜繪制等提供幫助。

4　青天葵的功能基因研究

進入后基因組時代以來，植物功能基因的研究逐漸成為科學家們關注和研究的熱點，尤其是有關植物生長、發育、衰老和死亡等生命過程中所伴隨的各種生理生化過程的基因調控機制的研究，可為種質資源的保護和擴大利用提供依據。

當前人們主要嘗試通過組織培養和人工栽培來獲得青天葵資源時，卻面臨著煉苗下田、擴大種植和種苗稀缺等瓶頸問題，產量遠未能滿足市場和臨床需求。應用生物技術進行青天葵優良品種及產量提高等研究，有助于緩解當前資源緊缺的現狀。何瑞領導的課題組［51-54］率先對青天葵的基因功能及其調控開展研究，構建了青天葵轉錄組及其數據平臺，利用生物信息學技術對青天葵次生代謝產物合成、生理過程等相關功能基因進行了挖掘，并分析了這些基因在青天葵不同組織中的表達水平；其中包括植物萜類MEP生物合成途徑的第一個關鍵限速酶1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）基因［52］、植物三萜類化合物合成MVA途徑的關鍵限速酶甲羥戊酸激酶（MVK）基因［53］和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）基因［53］等。還克隆獲得了青天葵器官大小調控基因NfEBP1 （Erb3-binding protein），并構建了該基因的原核表達載體［54］，為研究青天葵器官大小發育的調控機制奠定基礎。NEBP1的編碼區序列長1 188 bp，含395個氨基酸，分子量為43.5 kDa，功能預測該基因具有PA2G4細胞增殖功能，歸屬于APP_MetAP超級家族。此外，梁凌玲等［55-56］期望從改變青天葵植物的分枝模式來提高它的產量，從青天葵轉錄組數據中篩選獲得一個分枝發育相關基因NfLS，并克隆獲得了該基因的cDNA全長序列，NfLS編碼區序列長1191 bp，編碼396個氨基酸，預測表明其歸屬于植物特有的GRAS家族。同時分析了NfLS在青天葵中不同器官及24 h周期內的表達變化，構建了該基因的植物表達載體，為通過生物技術打破青天葵一葉一球莖的繁肓現狀奠定基礎。

5　展望

青天葵是我國珍稀瀕危名貴藥材，野生資源逐年枯竭，其資源緊缺問題亟待解決。早期，生物學家們在青天葵組織培養和人工栽培方面做了各種努力，已通過組織培養獲得青天葵球莖和再生苗，人工栽培技術也相當成熟。但也面臨煉苗下田、擴大種植和種苗稀少等瓶頸問題，仍未能真正解決青天葵資源匱乏、供不應求的現狀。青天葵的分子生物學研究起步較晚，但也已經取得了一定的進展。目前，利用現代分子生物學技術將實現青天葵及其近緣種、混偽品的分子鑒定，全面揭示其遺傳多樣性及品種間的親緣關系，為青天葵種質資源的保護和合理利用提供重要參考；而青天葵轉錄組數據庫的構建，促進了對該植物的生長發育和代謝調控等相關功能基因研究的逐步深入。

基因的表達趨勢與植物形態、代謝物的產生和積累等息息相關，深入了解外界環境、激素等因素與生長發育相關基因的互作關系，有利于人工栽培過程中通過噴施激素或控制其他條件來調控基因的表達，進而達到改善作物性狀、提高產量和質量等目的。國內外學者應用分子設計育種、轉基因和基因編輯等生物技術已經培育出抗蟲性強的棉花、玉米、水稻等，還有富含維生素A的“金米”、耐儲藏的保鮮番茄等。實踐證明分子育種極大地加快了農作物的選種、育種、性狀和品質改良的進程，縮短了育種周期，這些成果同樣可為改進青天葵的產量和品質提供有價值的參考。可以預見，通過充分利用青天葵轉錄組數據及其基因資源，大規模挖掘基因信息，深入研究候選基因的功能，明確青天葵生長發育過程中的基因調控網絡，將大大加速利用基因工程手段促進青天葵的種質資源保護和開發的進程。

參考文獻：

［1］廣東省食品藥品監督管理局.廣東省中藥材標準（第1冊）［M］.廣州：廣東科技出版社，2004：122.

［2］南京中醫藥大學.中藥大辭典（上冊）［M］.2版.上海：上海科學技術出版社，2006：1731.

［3］張麗，趙鐘祥，林朝展，等.青天葵化學成分的研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（4）：453.

［4］陳金嫚，韋柳斌，袁經權，等.青天葵指紋圖譜研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24（12）：2927.

［5］韋柳斌，陳金嫚，周光雄.青天葵大極性化學成分研究［J］.天然產物研究與開發，2014（1）：43.

［6］杜勤，葉木榮，王振華，等.青天葵鎮咳、平喘藥理作用研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2006，23（1）：45.

［7］焦楊，邱莉，謝集照，等.青天葵黃酮F的抗炎作用［J］.中國醫藥工業雜志，2014（2）：143.

［8］許銀姬，林家揚，陳遠彬，等.青天葵注射液對內毒素誘導急性肺損傷大鼠炎癥細胞因子調控的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2014，31（5）：772.

［9］龐耀鏡，李滿聯.青天葵鑒別特征的觀察［J］.中藥材，1992，15（12）：29.

［10］廖月葵，何報作，朱意麟，等.青天葵與其易淆品番薯葉的葉形態脈序圖譜的鑒別特征［J］.時珍國醫國藥，2012，23 （7）：1750.

［11］劉心純.兩種青天葵的鑒別研究［J］.中藥材，1996，19 （12）：612.

［12］陳鵬仙，滕耀星.青天葵與幾種偽品的區別［J］.中藥材，1987，10（2）：22.

［13］曾佩玲，何茂金，胡延松，等.青天葵的生藥鑒別［J］.中藥材，1989，12（12）：26.

［14］樂凡.青天葵的真偽鑒別［J］.黑龍江中醫藥，2006（6）：46.

［15］甄漢深，莫緩恒，周燕園，等.青天葵化學成分定性鑒別的試驗研究［J］.廣西中醫學院學報，2007（1）：53.

［16］文和群，許兆然，Villa-Lobos J，等.中國南部石灰巖稀有瀕危植物名錄［J］.廣西植物，1993，13（2）：110.

［17］鄧錫青，梁學金，李月榕.毛唇芋蘭根莖的誘導與塊莖形成［J］.植物生理學通訊，1985，21（6）：40.

［18］何芙裳，何定全，陳幸華，等.青天葵組織培養繁殖技術的研究［J］.熱帶作物學報，1990，11（1）：97.

［19］凌征柱，梁學金，潘素芬，等.青天葵誘導多球莖及叢生苗的研究［J］.種子，1998，17（5）：35.

［20］吳慶華，凌征柱，陸永梅.中藥青天葵組培球莖栽培的研究［J］.時珍國醫國藥，2001，12（10）：958.

［21］梁學金，凌征柱，潘素芬.青天葵試管苗與野生苗的形態差異［J］.特產研究，1993（1）：28.

［22］凌征柱，梁學金，潘素芬，等.青天葵組織培養栽培苗與野生引種栽培苗電泳研究［J］.種子科技，1999（2）：30.

［23］杜勤，陳文利，王振華，等.青天葵組織培養及植株再生的研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（11）：812.

［24］陳欽祥.青天葵的組織培養［D］.南寧：廣西大學，2006.

［25］黃肇宇，曾詩媛，王云波，等.青天葵走莖誘導與增殖的初步探究［J］.玉林師范學院學報，2012，33（5）：73.

［26］李斌，陳欽祥，楊美純.青天葵球莖的組織培養［J］.安徽農業科學，2008，36（35）：15358.

［27］李守嶺，白燕冰，高燕，等.青天葵球莖快繁組培技術研究［J］.廣西農業科學，2009（7）：810.

［28］袁源.青天葵擴繁體系的建立和優化［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2010.

［29］張曉麗，梁凌玲，詹若挺，等.嶺南道地藥材青天葵的組織培養與植株再生［J］.北方園藝，2012（19）：140.

［30］潘學峰，符式欽，戴衛端.青天葵葉片離體培養及植株再生［J］.海南大學學報：自然科學版，2001，19（4）：358.

［31］杜勤，程鳳麗，龔雪梅.青天葵種子無菌萌發試驗研究［J］.廣州中醫藥大學學報，2013，30（2）：233.

［32］杜勤，龔雪梅，程鳳麗.不同包埋基質對青天葵人工種子萌發率的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2013，30（6）：901.

［33］張曉麗，梁凌玲，詹若挺，等.藥用植物青天葵的懸浮培養條件優化［J］.廣東農業科學，2012（16）：32.

［34］張曉麗，何瑞，童家赟，等.藥用植物青天葵葉片原生質體的制備與純化［J］.安徽農業科學，2011，39（35）：21644.

［35］張曉麗.青天葵組織培養與原生質體分離的研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2012.

［36］程鳳麗.青天葵快繁條件優化及多倍體誘導、鑒別研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2013.

［37］徐乃良.青天葵高產栽培技術［J］.廣西林業，1994（1）：25.

［38］徐乃良.青天葵高產栽培技術（續）［J］.廣西林業，1994（2）：15.

［39］凌征柱，潘素芬，梁學金.提高青天葵開花結果率的研究［J］.種子世界，1998（12）：19.

［40］杜勤.青天葵藥材規范化種植（GAP）研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2005.

［41］唐美瓊，李小勇，翟勇進，等.不同栽培基質對青天葵生長及生理特性的影響［J］.江蘇農業科學，2014（8）：250.

［42］唐美瓊，翟勇進，李小勇，等.基質栽培中營養液對青天葵生長、抗氧化酶活性及氨基酸含量的影響［J］.中藥材，2014，37（12）：2127.

［43］翟勇進，唐美瓊，白隆華.噴施三種葉面肥對青天葵產量的影響［J］.中藥材，2014，37（5）：750.

［44］朱華，傅鵬，王孝勛.青天葵與毛葉青天葵種間關系的RAPD鑒定：中華中醫藥學會第九屆中藥鑒定學術會議［C］.中國浙江建德，2008.

［45］魏智強.青天葵遺傳多樣性研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2009.

［46］杜勤，魏智強，田軍.基于RAPD的青天葵遺傳多樣性及鑒別研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20（6）：554.

［47］黃瓊林，馬新業，何瑞，等.基于條形碼ITS2序列的青天葵及其混偽品分子鑒別［J］.生物技術通報，2012（12）：173.

［48］黃瓊林，梁凌玲，何瑞，等.青天葵及其混偽品的rbcL基因序列鑒定研究（英文）［J］.熱帶作物學報，2012，33（9）：1630.

［49］黃瓊林，梁凌玲，何瑞，等.應用matK基因鑒別青天葵及其常見混偽品［J］.廣西植物，2014，34（3）：299.

［50］周雨晴，杜沛霖，傅鵬，等.青天葵ISSR-PCR體系優化及引物篩選［J］.中國實驗方劑學雜志，2014（21）：95.

［51］黃瓊林.青天葵轉錄組特征研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2013.

［52］黃瓊林，何瑞，詹若挺.青天葵1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因片段的鑒定和分析［J］.北方園藝，2015（22）：114.

［53］黃瓊林，何瑞，詹若挺.青天葵甲羥戊酸激酶基因的編碼蛋白預測和表達分析［J］.熱帶作物學報，2015，36（6）：1099.

［54］黃瓊林，何瑞，詹若挺，等.青天葵EBP1基因原核表達載體的構建（英文）［J］.Agricultural Science & Technology，2012 （6）：1211.

［55］梁凌玲.青天葵分枝發育相關基因NfLs的克隆與表達分析［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2014.

［56］陳秀珍，梁凌玲，李俊仁，等.攜帶芋蘭屬LATERAL SUPPRESSOR（LS）-EGFP融合基因植物表達載體的構建［J］.分子植物育種，2015，13（12）：2843.

【責任編輯：賀小英】

·文獻研究·

中圖分類號：R931

文獻標志碼：A

文章編號：1007-3213（2016）03 - 0415 - 04

DOI：10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．03．029

收稿日期：2015-12-22

作者簡介：陳秀珍（1989-），女，在讀碩士研究生；E-mail：xiuzhenchan@163.com

通訊作者：何瑞，女，研究員，博士研究生導師；E-mail：ruihe@gzucm.edu.cn

基金項目：教育部留學回國人員科研啟動項目（教外司留［2009］1001號）；中央財政支持地方高校發展專項資金項目—南藥可持續利用研究與綜合開發利用技術平臺（粵財教［2010］358號）；廣東省協同創新中心創新科研團隊建設項目（編號：A1-AFD01514A04）