產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐藥機制及流行病學(xué)研究進展*

陳紹淳 綜述，張 娟 審校

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,廣東汕頭 515000)

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產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌耐藥機制及流行病學(xué)研究進展*

陳紹淳 綜述，張 娟△審校

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,廣東汕頭 515000)

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶； 耐藥機制； 流行病學(xué)

自2009年報道產(chǎn)NDM-1的腸桿菌后，“超級細菌”這一概念為公眾所熟知，這一類耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌常表現(xiàn)為多重耐藥菌(MDR)，甚至泛耐藥菌(PDR)，對幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，并使酶抑制劑(克拉維酸等)失效，使臨床治療陷入被動。腸桿菌主要耐藥機制為產(chǎn)碳青霉烯酶，水解β-內(nèi)酰胺類抗生素而表現(xiàn)耐藥性狀。肺炎克雷伯菌(CPKP)常見于人體呼吸道、消化道，是一種條件致病的腸桿菌科細菌，臨床檢出率高。近年來產(chǎn)碳青霉烯酶類CPKP報道日漸增多，盡管總體上檢出率并不高(除了南亞大陸，均<7%)[1-2]。但CPKP已在世界多地出現(xiàn)暴發(fā)流行，同時也有在自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)CPKP的報道[3]。表明其播散趨勢不容樂觀，研究CPKP的耐藥機制及其流行病學(xué)規(guī)律，對此類感染的防控具有重要意義。

1 耐藥機制

碳青霉烯酶是一類能廣譜水解β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解酶。可以使含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素失效。是CRKP最常見的耐藥機制。編碼酶的基因既可位于基因組DNA上，也可位于質(zhì)粒上，因為水平基因轉(zhuǎn)移元件的存在，可以對各種耐藥基因進行整合，并通過質(zhì)粒進行傳播，使耐藥基因的傳播跨越生殖隔離，耐藥性更加具有傳播性。根據(jù)Ambler分子分類法，可以把碳青霉烯酶分為A、D、B 3類。

1.1 A類碳青霉烯酶 A類碳青霉烯酶是一類絲氨酸蛋白酶，包括KPC、IMI、SME、GES、NMC、SHV 6種。其中NMC、IMI和SME位于染色體上，而KPC、GES則常見于質(zhì)粒上，其余染色體和質(zhì)粒均可見。此類碳青霉烯酶可水解包括碳青霉烯類、頭孢菌素類、青霉素類和氨曲南。

對于CPKP，以KPC酶最為常見。KPC族酶自1996年于美國第1次報道以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)KPC-1至KPC-11 11種亞型[4]。KPC酶對β-內(nèi)酰胺類抗生素水解能力強，應(yīng)用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(克拉維酸等)對其效果不佳。有報道稱應(yīng)用3倍藥物濃度的美羅培南、替加環(huán)素和克林霉素可以提高產(chǎn)KPC酶的CPKP感染患者生存率[5]。但對于這種用藥組合是否會對患者帶來不良反應(yīng)，持續(xù)使用高濃度的碳青霉烯類藥物是否會進一步推高CPKP的最小抑菌濃度(MIC)值等問題有待進一步研究。KPC酶常位于IncA/C型和IncFIIK+FIBK型質(zhì)粒的Tn4401轉(zhuǎn)座子上，該質(zhì)粒具有宿主種類多、分布范圍廣的特點，更加速了KPC基因的傳播。KPC基因最初在相鄰的地域間傳播，自美國第1次報道，現(xiàn)已經(jīng)在亞洲、歐洲、中東地區(qū)普遍報道[6]。以往認為CPKP多為院內(nèi)感染常見的普通型，極少對身體健康的人致病，近期中國大陸地區(qū)發(fā)現(xiàn)了攜帶KPC-2基因的莢膜K1型高致病性CPKP，此類病原菌對人有強致病性，高致病性的CPKP感染會給臨床用藥帶來很大挑戰(zhàn)[7]。

相對于KPC，其他幾種A類碳青霉烯酶報道較少，位于染色體上NMC、IMI和SME其擴散能力較差，并未呈現(xiàn)大規(guī)模流行的趨勢。GES屬于弱水解性的碳青霉烯酶，很多單表達GES的菌表現(xiàn)型常為對碳青霉烯類抗生素敏感性降低或者中介，根據(jù)耐藥性初篩易導(dǎo)致漏檢，在GES家族中，GES-5基因的水解能力最強，最初于韓國報道此酶在CPKP中的存在[8]。

1.2 B類碳青霉烯酶 B類碳青霉烯酶屬于金屬酶類，包括NDM、IMP、VIM、GIM、SPM。與其他兩類不同，其活性位點上包含金屬離子，對亞胺培南、厄他培南等常見碳青霉烯類抗生素有很強的水解活性。多位于可接合質(zhì)粒上，并與整合子、插入序列等可移動性基因元件結(jié)合，使其具有很強的傳播能力[9]。金屬酶活性可被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制，據(jù)此原理，亞胺培南藥敏紙片添加0.5 mmol/L的EDTA制成的組合紙片和單純亞胺培南紙片聯(lián)合應(yīng)用可用于檢測腸桿菌科的金屬酶表型。

B類酶中檢出率呈現(xiàn)地域分布特點，其中NDM酶自2009年在印度新德里檢出并因此得名，成為南亞地區(qū)檢出率最高的B類碳青霉烯酶，在印度某些城市，檢出率甚至超過60%，并且成為重要的輸出地區(qū)[10-11]。其最常見NDM-1型，多次在該地區(qū)暴發(fā)流行，現(xiàn)在攜帶NDM酶的CPKP在中國、韓國、日本等東亞國家檢出率也呈逐年升高。中國上海報道1次產(chǎn)NDM-1型的CPKP在新生兒科的暴發(fā)流行[12]。同時在歐洲、美洲大陸等與南亞并無接壤的地區(qū)也相繼報道，歐洲表達NDM-1酶的CPKP報道，多為輸入性病例，其余NDM型報道較少，西班牙、菲律賓相繼發(fā)現(xiàn)攜帶NDM-7型基因的CPKP，較于NDM-1，NDM-7型酶對碳青霉烯類水解效率更高，應(yīng)引起重視。VIM和IMP酶的水解效率更高，其多在歐洲及美洲大陸出現(xiàn)流行[13-14]。希臘發(fā)現(xiàn)攜帶VIM-19的CPKP，并確認為本土案例，所幸的是，VIM和IMP酶檢出率并不高，其并未如NDM型酶迅速擴散。

1.3 D類碳青霉烯酶 D類碳青霉烯酶是一類苯唑西林酶，多位于染色體上，目前已發(fā)現(xiàn)超過400種OXA家族基因，其中232種對常見碳青霉烯類抗生素均有低水解活性，且不被克拉維酸等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制[15]。多見于鮑曼不動桿菌，CPKP偶見報道，主要為OXA-48型[16]。產(chǎn)OXA-48型酶的CPKP常見于土耳其、約旦、伊朗等中東、中亞地區(qū)報道，歐洲病例多以輸入性病例為主，一項法國的研究表明，納入研究的病例中，53%的OXA-48陽性CPKP感染患者均有國外旅游史[17]。近期西班牙的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶OXA-245的CPKP[18]。與其他幾種廣泛報道的碳青霉烯酶一樣，OXA也常與各種基因元件結(jié)合，并通過基因元件在不同菌株之間擴散。對一株分離自土耳其的OXA-48攜帶的CPKP的研究表明，其位于可接合的質(zhì)粒上，但并未與Ⅰ類整合子相結(jié)合[19]。攜帶OXA基因的CPKP常在用藥后出現(xiàn)耐藥性增強，據(jù)Lunha等[20]研究，當(dāng)攜帶OXA-48酶的CPKP孔蛋白Ompk36變異時，或合并表達其他碳青霉烯酶時，可表現(xiàn)出較原來更高水平的耐藥，這也是此類CRKP治療過程中耐藥性變化的主要原因。

2 產(chǎn)碳青霉烯酶的CPKP流行病學(xué)研究

2.1 分型技術(shù)的研究進展 克隆分型技術(shù)可以了解特定時間、空間內(nèi)細菌的分布情況，追蹤其傳播途徑，并通過分析不同克隆型之間情緣關(guān)系遠近來研究其演變規(guī)律。目前，用于細菌分型的技術(shù)主要有多位點序列分型(MLST)、脈沖電場凝膠電泳(PFGE)、利用隨機引物的腸桿菌基因間共有多重序列的ERIC-PCR分型和全基因組測序分型技術(shù)。其中PFGE技術(shù)具有分辨率高的特點，是公認的細菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。但操作繁瑣耗時，且目前尚未形成通用的標(biāo)準(zhǔn)化操作，各實驗室之間的分型結(jié)果可重復(fù)性差；ERIC-PCR法簡便易行，但分辨率較低[22]；全基因組測序精度高，方便易行但其高昂費用阻礙了大規(guī)模應(yīng)用，MLST技術(shù)是基于全球菌株數(shù)據(jù)庫[23]。通過菌株比對進行分型，其優(yōu)點在于可以與數(shù)據(jù)庫中克隆型進行比對，分析其傳播規(guī)律，由于是建立在比對基礎(chǔ)上的技術(shù)，其不足之處在于數(shù)據(jù)庫中沒有的克隆型無法進行分析，但隨著提交新克隆型的研究者增多，MLST的數(shù)據(jù)庫也正趨于完善，其在研究細菌傳播、演變上的價值愈加受到研究者的重視。

2.2 CPKP的MLST數(shù)據(jù)研究 把本地區(qū)的臨床菌株與MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，可以了解本地區(qū)流行的主要克隆型，克隆型的流行同樣具有地域分布特性。由于KPC、NDM這兩型碳青霉烯酶傳播廣，受到關(guān)注高，以下主要介紹這兩型碳青霉烯酶攜帶菌株的克隆型流行情況。

由于KPC主要在CPKP上檢出，MLST數(shù)據(jù)庫中有記錄的相關(guān)克隆型達57種，未計入數(shù)據(jù)庫中的克隆型也呈多樣性。攜帶KPC基因中ST258的CPKP占46.3%，系統(tǒng)發(fā)育樹分析提示該型可能為攜帶KPC的CPKP的祖先型。通過全基因組測序技術(shù)，對ST258的CPKP分析表明，該克隆型已經(jīng)成為美國醫(yī)療機構(gòu)常見的克隆型[24]。隨著KPC的擴散，越來越多的克隆型在各地發(fā)現(xiàn)，在保加利亞大學(xué)附屬醫(yī)院，ST15型的產(chǎn)KPC-2酶的CPKP是其主要克隆型[25]。意大利的瓦萊達奧斯塔地區(qū)CPKP主要流行ST101、ST1789、ST512和ST405這4種型[26]。這些報道表明KPC攜帶的菌株正在增加，表明KPC基因的擴散趨勢不容樂觀。

表達NDM酶的CPKP最初發(fā)現(xiàn)于南亞，在2009年在臨床上第1次檢出之前，已于2006年在印度新德里的自然水體中檢出攜帶NDM-1基因的腸桿菌[3]，并發(fā)現(xiàn)其屬于多個克隆型，表明早在NDM基因流行之前，在流行地環(huán)境中就已存在一個數(shù)量相當(dāng)?shù)姆N群，加之其與多種水平基因轉(zhuǎn)移元件相結(jié)合[27]，具有播散能力強，短短幾年間便在世界范圍內(nèi)擴散，但因發(fā)現(xiàn)時間較短，收入MLST數(shù)據(jù)庫的產(chǎn)NDM型CPKP克隆型只有17個克隆型。但近年來發(fā)表的文獻表明，攜帶NDM的CPKP克隆型正在不斷增多，印證了此基因不斷播散的趨勢，在中國長沙報道了1次產(chǎn)NDM-1的CPKP暴發(fā)，其主要克隆型為ST17[28]。在希臘，報道了兩次產(chǎn)NDM-1酶的ST11型CPKP暴發(fā)流行除了院內(nèi)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)攜帶NDM基因的克隆型在增加，自然環(huán)境中的帶有NDM基因的種群也在不斷地發(fā)現(xiàn)，在西班牙，3所醫(yī)院內(nèi)流行的產(chǎn)NDM-7酶的CPKP同屬ST437型，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，此型CPKP在當(dāng)?shù)丨h(huán)境中屬于優(yōu)勢種群，這也促成了此次流行[29-30]。這表明以往院內(nèi)流行的產(chǎn)NDM的CPKP開始在當(dāng)?shù)丨h(huán)境中出現(xiàn)。

3 小 結(jié)

自從抗生素問世，抗生素與細菌的“軍備競賽”就愈演愈烈，隨著碳青霉烯類抗生素應(yīng)用廣泛，細菌對其耐藥率也逐年攀升，CPKP作為院內(nèi)感染的常見菌種，表達碳青霉烯酶意味著其幾乎對所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，加之各種水平基因轉(zhuǎn)移元件的存在，使碳青霉烯酶耐藥基因具有易于擴散的特點，使其可通過水平傳播，擴散耐藥基因，目前發(fā)現(xiàn)越來越多的產(chǎn)碳青霉烯酶的CPKP克隆型，意味著攜帶碳青霉烯酶基因的CPKP種群正在不斷擴大，同時在多地自然環(huán)境中也發(fā)現(xiàn)種群數(shù)目可觀的環(huán)境庫，由此增加了相關(guān)菌株暴發(fā)流行的風(fēng)險，給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)。

通過使用PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對碳青霉烯酶耐藥基因進行研究可以了解其耐藥機制，對研制針對性的新型抗生素具有啟迪意義，通過各種分型技術(shù)進行流行病學(xué)研究，有助于掌握各地CPKP的流行情況，研究其流行規(guī)律，并通過規(guī)范用藥、加強院感監(jiān)測等手段控制其流行。

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廣東省高水平大學(xué)重點學(xué)科建設(shè)資助項目(2015049)。

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A

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