海洋創傷弧菌LAMP快速診斷方法的建立與評價*

張麗娜，王明義，楊小蕾，曹　源，張萍萍，胡成進△

(1.遼寧醫學院，遼寧錦州 121001；2.威海市立醫院，山東威海 264200；3.濟南博科生物

科技有限公司，山東濟南 250100；4.濟南軍區總醫院，山東濟南 250031)

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·論著·

海洋創傷弧菌LAMP快速診斷方法的建立與評價*

張麗娜1，王明義2，楊小蕾3，曹源4，張萍萍1，胡成進4△

(1.遼寧醫學院，遼寧錦州 121001；2.威海市立醫院，山東威海 264200；3.濟南博科生物

科技有限公司，山東濟南 250100；4.濟南軍區總醫院，山東濟南 250031)

摘要:目的利用環介導等溫擴增(LAMP)技術，建立海洋創傷弧菌快速、簡便、特異且敏感的檢測方法，并對該方法的特異性和靈敏度進行評價。方法選取海洋創傷弧菌溶細胞素(vvhA)基因作為靶基因，根據GenBank公布的序列設計4條LAMP引物；對47株細菌(包括20株弧菌屬細菌)進行LAMP和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，并做特異性比較；對創傷弧菌M06株增菌液10倍倍比稀釋，提取DNA后進行靈敏度的檢測，并與常規PCR作比較；構建含vvhA基因片段的重組質粒，作為LAMP反應體系的標準陽性對照。結果常規PCR實驗出現假陽性結果，而LAMP實驗只有海洋創傷弧菌出現陽性擴增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結果，表明引物的特異性較好，加入鈣黃綠素和電泳結果相一致；針對vvhA基因建立的LAMP技術其最低檢測下限為每個反應4×10 CFU，是常規PCR(每個反應4×102CFU)的10倍，呈現較好的靈敏度。重復實驗過程兩遍，PCR和LAMP技術檢測結果穩定。結論建立了一種用于檢測海洋創傷弧菌的LAMP檢測方法，該方法特異性強，靈敏度高，方便快捷，特別適合用于現場和床旁的快速檢測。

關鍵詞:海洋；創傷弧菌；環介導等溫擴增；快速診斷；聚合酶鏈式反應

海洋創傷弧菌是一種分布于亞熱帶淺海水域及海產品中的革蘭陰性弧菌，該菌的生長繁殖環境不同于陸地菌種，具有高鹽、高鈉、低溫、乏氧、寡營養的特點，人主要通過生食生蠔等海產品感染，從而導致胃腸炎等消化系統疾病[1]，或者經海水浸泡感染傷口致蜂窩性組織炎或菌血癥等，此類感染進展迅速，病死率高達50%[2]，尤其對肝功能低下的患者易感。海洋創傷弧菌因其生長繁殖的特殊性，未引起實驗室的足夠重視，且缺乏專業培養基對其進行鑒定，使得感染后存在鑒定困難。傳統的鑒定方法主要是分離培養和生化鑒定，這類方法繁瑣、費時、費力，并且存在易受人為和試劑的影響或需要昂貴的微生物鑒定系統的缺陷[3]。隨著分子生物學技術的發展，以聚合酶鏈式反應(PCR)為代表的病原菌核酸快速檢測技術得到了廣泛應用，但它們都需要昂貴的特殊儀器、試劑和專業技術人員，檢測成本較高，不適合基層及現場的快速檢測[4]。2000年日本學者Notomi等[5]發明了一種新型的基因診斷技術，即環介導等溫擴增(LAMP)技術。該技術是在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，利用特別設計的4段引物來識別靶基因的6個區域，恒溫條件下(60～65 ℃)1 h內就可以對目的基因進行高效、特異的復制[6-9]。此外，該技術無需購置昂貴的PCR分析儀，操作簡單，可用于現場的快速檢測，近年來已得到廣泛應用。本研究針對海洋創傷弧菌溶細胞素(vvhA)基因設計了4條引物，建立快速診斷海洋創傷弧菌的LAMP技術，可視化判斷結果，并對該方法進行了應用評價。

1材料與方法

1.1菌株來源本實驗所用的菌株共47株，其中海洋創傷弧菌(M06)為韓國首爾大學食品生物技術與毒理營養研究所Sang Ho Choi惠贈，其余弧菌屬細菌來源于中國海洋微生物菌種保藏管理中心(青島)，其他菌株均為濟南軍區總醫院臨床分離保存菌株。

1.2儀器與試劑恒溫金屬浴(濟南博科生物科技有限公司)，低溫高速離心機Centrifuge 5430R(德國Eppendorf公司)，熒光凝膠成像分析系統(美國UVP公司)，TC-XR型基因擴增儀(日本BIOER公司)。Bst DNA聚合酶(8 U/μL)購于New England Biolabs公司，三磷酸脫氧核苷酸(dNTP，10 mol/L)和DNA標記物均購于大連寶生物工程有限公司，鈣黃綠素購于北京藍譜科技有限公司，所有試劑均在有效期內使用。

1.3方法

1.3.1細菌培養及DNA模板的制備按常規操作規程采用三區劃線法取弧菌屬細菌接種于2216E平板，培養溫度為28 ℃。非弧菌屬細菌接種于血平板，培養溫度為37 ℃，置于培養箱中培養過夜。采用煮沸法提取細菌DNA：取50 μL雙蒸水(ddH2O)于1.5 mL EP管中，調菌液至1～2個濁度，震蕩15 s，煮沸10 min后立即冰浴3 min，13 000 r/min離心5 min，取上清作為DNA模板，-20 ℃保存備用。革蘭陽性菌則需要加入溶菌酶后煮沸提取。

1.3.2LAMP引物的設計與合成根據GenBank數據庫中收集的vvhA基因序列進行LAMP引物設計(http://primerexplorer.jp/e/)，篩選出一套最佳引物(2對)，其中兩條外引物為F3、B3，內引物為FIP、BIP(引物序列見專利申請內容)，設計好的引物交由Invitrogen公司合成。

1.3.3LAMP反應體系總體積25 μL，具體組分包括：10×緩沖液、dNTP、引物、甜菜堿、硫酸鎂(MgSO4)、Bst酶、鈣黃綠素、DNA模板等(專利申請內容)，輕微混勻瞬時離心后加入20 μL滅菌液體石蠟密封，置于恒溫金屬浴中，反應條件設置為63 ℃，1 h；85 ℃，5 min終止反應。

1.3.4vvhA基因的克隆和陽性對照的建立用LAMP實驗的兩條外引物F3/B3進行PCR擴增，反應體系(25 μL)：模板2 μL、Premix Taq 12.5 μL、F3/B3(5 μmol/L)各1 μL、ddH2O 9.5 μL。反應條件：94 ℃ 8 min，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，72 ℃ 8 min；共30個循環。擴增產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果，將217 bp的擴增目的片段切膠回收后，與PMD18-T載體連接，16 ℃ 2 h后4 ℃冰箱過夜。將連接產物轉入大腸埃希菌DH5α感受態細胞，涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養基中，37 ℃培養過夜后挑取單克隆菌落搖菌后經PCR驗證送測序，測序成功后提取質粒作為標準陽性對照。

1.3.5LAMP反應產物的判斷(1)肉眼判讀結果：反應結束后肉眼觀察結果，反應液由橙色變為綠色則判為陽性，保持橙色則判為陰性。(2)瓊脂糖凝膠電泳：6 μL擴增產物與1 μL上樣緩沖液混勻點樣于含0.1 μL/mL GoldviewⅠ型核酸染料的2%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳25 min，電泳顯示LAMP特征性梯狀條帶則判為陽性，否則判為陰性。

1.3.6PCR和LAMP法檢測創傷弧菌的特異性分析將4株海洋創傷弧菌、3株副溶血弧菌、3株哈維弧菌、3株美人魚弧菌、3株查格斯弧菌、2株海洋溶藻弧菌、1株費氏弧菌、1株弗氏弧菌，臨床分離的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、不動桿菌、嗜麥芽假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸球菌各3株用上述反應體系進行LAMP和常規PCR檢測。

1.3.7PCR和LAMP法檢測海洋創傷弧菌的靈敏度將海洋創傷弧菌M06株增菌液培養過夜后，進行10倍系列倍比稀釋，從101～109稀釋液中各吸取20 μL至無菌平皿中，傾注冷卻的2216E液體培養基后混勻，每個稀釋度做兩個平行，37 ℃培養48 h計數菌落數。吸取各濃度稀釋液1 mL，提取DNA后用上述擴增條件同時進行LAMP和PCR檢測。

2結果

2.1vvhA基因的克隆和陽性對照的建立用F3/B3作為引物，普通PCR擴增，電泳顯示條帶與目的條帶大小一致(217 bp)，見圖1。將此條帶切膠回收成功與PMD18-T載體連接，并轉入大腸埃希菌DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB培養基中，過夜培養PCR驗證后測序結果顯示已成功構建含vvhA目的片段的重組質粒，可以作為LAMP實驗的標準陽性對照。

M：DNA分子量標記物DL2000;T:vvhA基因片斷陽性擴增。

圖1PCR vvhA電泳結果

2.2PCR和LAMP法檢測海洋創傷弧菌的特異性分析以vvhA基因重組質粒為標準陽性對照，ddH2O為陰性對照，PCR和LAMP技術檢測上述菌株。結果顯示，常規PCR除4株海洋創傷弧菌出現陽性外，1株副溶血弧菌、1株海洋溶藻弧菌也出現陽性；而LAMP實驗只有海洋創傷弧菌出現陽性擴增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結果，表明引物的特異性較好，加入鈣黃綠素和電泳結果相一致。見表1。

2.3PCR和LAMP法檢測海洋創傷弧菌的靈敏度分析海洋創傷弧菌MO6培養物進行傾注平板計數，已測定的初始菌液濃度為2×108CFU/mL，10倍倍比稀釋的菌液濃度分別為2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101CFU/mL。所對應反應體系中的濃度為每個反應4×104、4×103、4×102、4×101、4×100、4×10-1、4×10-2CFU。對不同稀釋度的模板DNA進行常規PCR(F3/B3作引物)和LAMP實驗，發現針對vvhA基因設計的引物最低檢測下限為每個反應4×10 CFU，是常規PCR(每個反應4×102CFU)的10倍，呈現較好的靈敏度。兩種實驗方法檢測海洋創傷弧菌的靈敏度分析結果見圖2，LAMP檢測海洋創傷弧菌靈敏度顯色分析見圖3(見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”)。重復實驗過程兩遍，PCR和LAMP法檢測結果穩定。

A：LAMP實驗；B：常規PCR；M：DNA分子量標記物DL2000；1：濃度為每個反應4×104CFU；2：濃度為每個反應4×103CFU；3：濃度為每個反應4×102CFU；4：濃度為每個反應4×10 CFU；5：濃度為每個反應4×100CFU；6：濃度為每個反應4×10-1CFU；7：濃度為每個反應4×10-2CFU；8：陰性對照；9：陽性對照。

圖2兩種實驗方法檢測創傷弧菌的靈敏度分析

3討論

隨著海洋作業活動的日益頻繁，海洋致病菌感染性疾病的發生逐年增加，但是由于海洋致病菌自身生長特點使其在臨床實驗室常規培養條件下難以生長，導致不能正確檢出而漏診，對此應引起醫學實驗室的高度重視。在海洋致病菌中創傷弧菌致病力最強，感染后常導致菌血癥及器官衰竭[10-12]。本研究采用LAMP技術建立了一種快速檢測海洋創傷弧菌感染的方法。構建了重組質粒作為檢測體系的陽性對照，并對此方法進行了特異性和靈敏度的評價。

本研究的核心技術在于引物的設計，需要考慮以下幾個方面。(1)熔解溫度(Tm)值： F1c/B1c引物區的Tm值控制在64～66 ℃，F2/B2、F3/B3則控制在59～61 ℃，LF/LB引物的Tm值約為60 ℃。(2)引物末端的穩定性：引物作為DNA合成的起點，其末端必須要有一定的穩定性，⊿G為吉布斯自由能變，該值越小，引物越容易與模板退火結合。設計原則為F3/B3、F2/B2、LF/LB的3′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol，F1c/B1c的5′端⊿G值小于或等于-4 kcal/mol。(3)GC百分含量：引物的GC百分含量在40%～65%。(4)引物之間的距離：F2與B2之間的距離(LAMP的擴增區域)為0～60 bp，F2與F3之間的距離為0～60 bp，而F2的5′端與F1的5′端的距離(環引物的區域)為40～60 bp[13]。

常規PCR需要配套控溫精密的儀器和復雜的實驗程序，檢測成本高[14]。而本研究所用的LAMP技術無需PCR儀，僅使用一臺恒溫金屬浴即可，操作簡單，并且本實驗使用47株細菌檢測該方法的特異性，結果顯示只有海洋創傷弧菌出現陽性擴增，其他樣品均為陰性，無假陽性和假陰性結果，且該方法特異性明顯高于常規PCR。另外，LAMP檢測海洋創傷弧菌的最低檢測限度達到每個反應40 CFU，靈敏度是常規PCR的10倍。

LAMP檢測結果判讀有濁度分析、電泳分析、染料比色分析等多種方式[15]。但是觀察濁度具有主觀性及靈敏度低等缺點，而通過電泳分析或者在反應完成后添加SYBR GreenⅠ熒光染料來判斷反應結果都使反應產物暴露于空氣中，極易造成假陽性，而反應擴增之前加入SYBR GreenⅠ會抑制LAMP反應的進行[16]。本研究中使用的鈣黃綠素檢測，將整個反應和檢測融合為一個過程，而且反應完成后不開蓋，很好地杜絕了污染，有效防止了假陽性[17]。

綜上所述，LAMP技術快速檢測海洋創傷弧菌用時少、操作簡單、特異性強、靈敏度高，且結果判讀簡單。在63 ℃條件下擴增1 h，便可根據顏色變化用肉眼來判定是否存在海洋創傷弧菌。近年來有報道顯示，聚乙二醇可以加速LAMP反應的進行[18]，相信采用LAMP技術檢測海洋創傷弧菌的方法將會逐漸完善并應用于臨床。筆者下一步研究將著重優化反應體系，提高引物純度，進一步提高反應的靈敏度，縮短反應時間，為該方法在臨床的推廣應用奠定基礎。

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Establishment and evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for detecting marine Vibrio vulnificus*

ZhangLina1，WangMingyi2，YangXiaolei3，CaoYuan4，ZhangPingping1,HuChengjin4△

(1.LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China；2.WeihaiMunicipalHospital,

Weihai,Shandong264200,China；3.Ji′nanBiobaseBiotechCo.,Ltd,Ji′nan,Shandong250100,China；

4.GeneralHospitalofJi′nanMilitaryRegionofPLA,Ji′nan,Shandong250031,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid,convenient,sensitive and specific method for the detection of marine Vbrio vulnificus by using loop-mediated isothermal amplification(LAMP) technique,and evaluate the specificity and sensitivity of this method.MethodsAccording to marine Vibrio vulnificus cytolysin(vvhA) gene sequence published by GenBank,a set of LAMP primers were designed.LAMP and polymerase chain reaction(PCR) amplification were carried out in 47 strains of bacteria(including 20 strains of Vibrio) and specificities of LAMP and PCR were compared.Serial ten-fold dilutions of an overnight Vibrio vulnificus M06 culture were prepared in sterile saline solution,and compared the sensitivity of LAMP with that of PCR after extracting DNA templates.A recombinant plasmid containing fragment of vvhA gene was constructed and set as a standard positive control of LAMP assay.ResultsFalse-positive results occurred in the conventional PCR,while in the LAMP assay positive amplifications were only seen in strains of Vibrio vulnificus and no false-positive or false-negative results were generated among 47 strains of bacteria,which indicated that primers had high specificity.Additionally,the results of electrophoresis were consistent with those after adding the calcein.The detection limit of LAMP was 4×10 CFU each reaction for detecting vvhA gene in pure culture,which was 10-fold more sensitive than that of conventional PCR(4×102CFU each reaction).It indicated that LAMP assay had good sensitivity.Repeated the test twice,the detection results of LAMP and PCR were both stable.ConclusionAn LAMP detection method for marine Vibrio vulnificus has been developed,which is highly specific,sensitive,convenient and suitable for rapid field detection and point-of-care testing.

Key words:marine；Vibrio vulnificus；loop-mediated isothermal amplification；rapid diagnosis；polymerase chain reaction

基金項目：全軍“十二五”科研重點項目(BWS12J014)。

作者簡介：張麗娜，女，檢驗技師，主要從事分子生物學研究。 △通訊作者，E-mail：hcj6289@163.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.05.001

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)05-0577-04

(收稿日期：2015-10-10)