PCR實驗室的污染及控制措施

郭利華

(成都艾迪康醫學檢測實驗室有限公司　610037)

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PCR實驗室的污染及控制措施

郭利華

(成都艾迪康醫學檢測實驗室有限公司610037)

目的分析PCR實驗室污染途徑。方法針對PCR實驗室不同的污染途徑采取不同的控制措施。結果通過一系列控制措施，達到了有效預防和控制污染的發生。結論PCR實驗由于具有高靈敏度，容易產生污染，必須針對不同污染途徑采取不同控制措施,以避免污染產生的風險。

聚合酶鏈反應；實驗室污染；控制措施

聚合酶鏈反應(PCR)技術是20世紀80年代慢慢發展起來的一種體外基因擴增技術。該項技術在人體外可在很短的一定時間內將極微量的靶核酸擴增上百萬倍，得到大量特定目的基因片段。隨著科學技術的發展，PCR技術具有特異、快速、敏感、產率高、易自動化、高通量、簡便等突出優點，已成為臨床實驗室常用的操作技術之一[1-2]。PCR技術在醫學領域重點應用于臨床醫學和預防醫學中[3]，大多數病原體都可通過PCR檢測為人類疾病的防治提供新的檢測手段，但在實際PCR實驗過程中極易發生污染，引起結果的假陽性。為保證結果的可靠性和準確性，結合有關資料和工作經驗分析PCR實驗室污染產生的途徑及控制措施。

1　PCR實驗室常見污染途徑

由于PCR技術敏感性特高，所以要求更高，影響因素也非常多，從樣品開始采集到結果報告發出，任何一處細小的失誤都會造成檢測結果的偏差，極其微量的污染都容易導致樣品出現假陽性結果。產生污染的主要途徑包括4個方面：(1)是PCR試劑污染。主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣器、容器、水及其他溶液被PCR核酸模板污染。(2)是標本間交叉污染。①收集標本的容器被污染。②標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外。③容器外黏有標本造成相互間交叉污染。④標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣器污染導致標本間污染。⑤有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠而擴散導致污染。(3)是PCR擴增產物污染。這是PCR中最常見的污染問題，因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染就可形成假陽性。(4)是實驗室中克隆質粒的污染。在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的實驗室，這個問題也比較常見。克隆質粒在單位容積內濃度高，另外在純化過程中需要較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及其具有很強的生命力，其污染可能性也很大[4]。由于一旦發生基因實驗室污染，該實驗就必須要停止，花費大量物力、人力直到尋找污染源為止，而且實驗報告結果必須作廢，需重新操作實驗，結果才可靠。

2　PCR污染的控制措施

2.1工作區域的嚴格劃分

2.1.1各個實驗區域設置合理，根據《CNAS-CL36醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》要求，合理分隔實驗室。將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行，特別注意標本處理及PCR產物的鑒定應與其他步驟嚴格分開。最好能劃分：標本處理區，PCR反應液制備區，PCR循環擴增區，PCR產物鑒定區。其實驗用品及吸樣槍應專用。實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA[5]。

2.1.2各個實驗區域要對不同設備、物品顏色有明顯的標記，如各區域使用專門的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、筆等，避免不同工作區域內的設備、物品混用。

2.2使用一次性用具吸頭、離心管、無粉塵手套、口罩等均為一次性使用。

2.3規范的系統設置設置規范的空調通風系統，盡可能采用全送全排空調系統。在進入各個操作區域需要嚴格單一流向進行，即試劑準備和貯存區→樣品制備區→PCR擴增區→擴增產物分析區，不得逆行。

2.4污染監測需要設立陽性對照、陰性對照，進行重復試驗，選擇不相同區域的引物進行PCR擴增等，做好污染監測，以便采取措施防止和消除污染。

2.5規范操作

2.5.1PCR實驗室人員必須進行上崗培訓，取得外部和內部上崗證后，方可從事基因擴增檢驗工作。

2.5.2在操作中勤換手套，且不能與管蓋內面接觸。吸頭、離心管裝上濾嘴才能用。

2.5.3要正確操作相關儀器設備，認真按照制訂的合理、科學的操作規程操作相關儀器設備，避免產生氣溶膠污染。

2.5.4取樣、加液(標本、反應液等)時應先高速離心將管蓋上液體沉于管底，動作輕快、以避免飛濺和產生氣溶膠污染環境。取樣應就近操作，避免較遠距離移樣。

2.5.5若在各區域操作發生試劑、樣品的外濺，此時工作人員先隔離其他未被污染的相關物品，戴上手套和生物防護裝置，用吸水紙吸干液體，對污染處用2 000 mg/L的次氯酸鈉消毒液覆蓋30 min，再用75%乙醇擦拭2遍，等試驗結束后用紫外線照射39 min[6]。

2.5.6若發生實驗室工作人員工作服、鞋、帽被污染時，必須立即脫掉并包裹好進行消毒處理，換上另外消毒好的工作服、鞋、帽等后方可繼續工作。如果污染重則停止當天的下一步工作或另換其他具有資質的人員進行工作。

2.5.7清潔工作及時、準確，每次實驗前后用500 mg/L的含氯消毒液擦拭地面及工作臺面，75%乙醇擦拭儀器設備，再用紫外線照射整個實驗區域及設備，時間不低于30 min。實驗室內的樣品溶液和擴增產物產生的氣溶膠是重要的污染源，故PCR實驗室要經常通風換氣和消毒。當試驗結束后產生的廢棄反應管、槍頭等廢棄物應置于2 000 mg/L的含氯消毒液中浸泡12 h以上。廢棄物需要經高壓滅菌后按醫療廢物進行消毒處理，避免污染實驗環境。

2.6科學合理的管理根據實際情況，制訂科學、合理的關于PCR相關制度文件、程序文件、標準操作規程及記錄表格等文件，文件相關內容一定要有科學性、前瞻性、、嚴謹性，并且操作性強，以便工作人員現場查閱和培訓學習。

目前PCR技術廣泛應用，已經得到長足發展，成為臨床一些疾病診斷和預防控制領域的有力工具。為避免在PCR實驗室內出現污染、假陰性及假陽性結果等現象，確保檢驗結果準確性，實驗人員應該不斷提升檢測能力，具備應對污染的能力，控制污染蔓延，將損失降到最小。

[1]Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nueleic Acids Res，1994，29(9)：51-52．

[2]朱永芳.實時熒光聚合酶鏈式反應檢測技術[M].北京：中國計量出版社，2013.

[3]林萬明.PCR技術操作和應用[M].北京：人民軍醫出版社，2012.

[4]Munoz N,Bosh FX,de Sanjose S,et al.Epidemiogic classification of human papillomavirus types associated with cervical Cacer[J].N Engl J Med,2003,348(6):518-527.

[5]黃雅，馮玉昆.HPV亞型檢測與宮頸癌篩查[J].醫學綜述，2007,13(19)：1453-1454.

[6]Herrero R,Castellsague X,Pawlta M,et al.Human papillomaviruses and oral caner:the international agency for research on cacer multcenter sdudy[J].J NATL Cancer Int,2003,95(1):1772-1783.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.067

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1673-4130(2016)16-2354-02

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