基因突變與骨髓增殖性腫瘤關系的研究進展

王朋，秦松，柳長柏，王君，鄒黎黎

(1.三峽大學人民醫院轉化神經科學&神經再生修復實驗室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學細胞治療研究所腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

基因突變與骨髓增殖性腫瘤關系的研究進展

王朋1，2，秦松1，2，柳長柏1，2，王君1，2，鄒黎黎1，2

(1.三峽大學人民醫院轉化神經科學&神經再生修復實驗室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學細胞治療研究所腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

骨髓增殖性腫瘤(MPN)是因為骨髓髓系細胞增殖導致外周血細胞計數增加的克隆性造血干細胞疾病。經典的Ph染色體陰性MPN由真性紅細胞增多癥(PV)、原發性血小板增多癥(ET)及原發性骨髓纖維化(PMF)組成，研究發現PV、ET及PMF的發病機制與多種基因的突變密切相關，包括Janus激酶2(JAK2)、促血小板生成素受體的編碼基因MPL及鈣網蛋白CRT。因此，本文著重以JAK2、MPL及CRT的突變介紹基因突變與MPN的關系的最新研究進展。

骨髓增殖性腫瘤；Janus激酶2；促血小板生成素受體編碼基因MPL；鈣網蛋白

骨髓增殖性疾病(Myeloproliferative disorder，MPD)屬于造血干/祖細胞惡性克隆性疾病，是由于骨髓中一系或多系造血細胞過度增長，導致外周血中一種或多種血細胞形態和功能正常的計數增加，此概念由Dameshek等[1]于1951年第一次提出。2008年，WHO將MPD更改為慢性骨髓增殖性腫瘤，并將其分類到造血和淋巴腫瘤疾病[2]。典型MPN可分為慢性粒細胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)、真性紅細胞增多癥(Polycythemia vera，PV)、原發性骨髓纖維化(Primary myelofibrosis，PMF)和原發性血小板增多癥(Essential thrombocythemia，ET)[3]，隨病程進展部分可轉化為其他疾病或各亞型之間相互轉化。MPN發病機制復雜，2005年之前僅有CML的發病被明確證明與Ph染色體密切相關，其余Ph陰性的MPN的發病機制尚不明確，且沒有特異性的分子診斷標志；但自2005年起，陸續有研究發現MPN患者中存在Janus激酶2(Janus Kinase 2，JAK2)、促血小板生成素受體的編碼基因MPL及鈣網蛋白(Calreticulin，CRT)的基因突變，且這些突變與MPN之間存在著密切的關系。

1 JAK2突變

Janus激酶(Janus kinase，JAK)屬于非受體型酪氨酸蛋白激酶，由JAK1、JAK2、JAK3及TYK2(Tyrosine kinase)構成，其中，JAK2基因位于9p24，由7個高度保守的JAK同源結構域(JAK homology，JH)組成[4]。羧基端包括JH1酪氨酸蛋白激酶區及JH2激酶相關區，氨基端含有FERM結構域(JH3-JH7)，其功能是為與JAK2相互作用過程中的各種信號通路提供結合位點。值得注意的是，JH1是具有酪氨酸激酶活性激酶結構域，JH2結構域有正常激酶結構卻無激酶活性，但在正常生理情況下自動抑制JAK2酪氨酸激酶活性，對JH1激酶活性產生負調控作用[5]。下游信號只有經過細胞生長因子的刺激才可產生從而使造血細胞增殖、分化。一旦JH2結構域發生變化，其自身對JH1抑制功能解除，JAK2酪氨酸激酶持續活化，受體持續磷酸化，導致造血細胞持續增殖、分化，從而引發一些高表達疾病。

JAK2突變發生在JH2結構域，原本位于12號外顯子中1849位鳥嘌呤G突變為胸腺嘧啶T，導致JAK2蛋白激酶結構域中蛋白質錯義編碼，617位纈氨酸轉變為苯丙氨酸[6]。JH2的自我抑制功能喪失，導致JAK2持續活化，使其在缺少配體的情況下與受體結合[7]，激活下游信號通路，導致造血細胞克隆性增殖，引起外周血細胞計數增加[8]。James等[9]對MPN患者進行基因學分析，于74例MPN患者(45例PV，17例ET，12例PMF)發現52例(40例PV，3例ET，9例PMF)存在JAK2 V617F突變，而對照組并未檢測到突變，并證實突變的JAK2可不依賴配體自發激活下游STAT信號通路。且發現在細胞生長因子刺激缺失的條件下，EPK/MAPK(Mitogen-activated protein kinase)和P13K/AKT通路能被激活，這些改變使凋亡減少，惡性細胞過度增殖。此現象表明，當存在JAK2 V617F突變時，MPN的發病機理與JAK2的抑制能力的喪失具有高度相關性，Levine等對MNP患者進行基因水平充分細致的研究，采用高通量基因測序法對JAK2進行測序，發現MPN患者存在V617F突變[4]；Quentmeier等[10]在對MPN致病機理進行充分研究后發現，MPN致病過程包括原癌基因(JAK2V617F)的激活和抑癌基因(細胞因子2抑制劑，suppressor of cytokine signaling-2，SOCS2)的失活。

Baxter等[6]也調查證實，JAK2 V617F突變發生在97%的PV患者、57%的ET患者和50%的PMF患者中。Vainchenker等[11]發現2%～3%的PV患者不存在V617F等位基因的突變，卻含有JAK2的12號外顯子突變，JAK2V617F陰性的ET和PMF患者占大約40%。其中，3%～8%與促血小板生成素受體的編碼基因突變有關。

2 MPL突變

人血小板生成素(TPO)受體(TPOR)的編碼基因MPL位于染色體1p34上，其編碼的蛋白存在于細胞質，細胞膜及細胞外。其中，胞膜區與胞漿區連接處存在一段含有515位色氨酸的兼性K/RWQFP序列，其主要功能是維持MPL的細胞質構象，此序列的缺失會導致在不依賴配體的情況下，下游信號的持續性活化，而515位色氨酸的突變就可導致受體自發激活[12]。在3%～8%的ET患者和PMF患者中存在515位色氨酸的突變[13-14]。氨基酸錯義突變導致不依賴TPO受體的活化信號的產生，其機制與MPL二聚體幾何構象的改變有關[15]。位于胞膜區與胞漿區連接處的515位色氨酸在正常生理情況下抑制了MPL跨膜區的螺旋及阻止了受體的自發激活[16]。而515位色氨酸突變為其他氨基酸，如亮氨酸、賴氨酸或精氨酸時，其抑制功能丟失導致了MPL持續活化；MPL蛋白表達水平的升高使得巨核細胞生成水平得到上調[17]，從而導致疾病的發生。

綜上可知，幾乎全部的PV與JAK2(97%與JAK2V617F突變相關，2%～3%與JAK2的12號外顯子突變相關)突變相關；大約60%的ET和PMF與JAK2 V617F突變相關，此外3%～8%的ET和PMF與MPL相關。2008年，JAK2和MPL與MPN的密切關系使得WHO成員重新修訂了MPN的診斷標準[18]；但是，超過30%的ET和PMF缺乏常用的分子標記，然而，2013年鈣網蛋白突變與MPN關系的發現彌補了該空白。

3 CRT突變

鈣網蛋白(Calreticulin，CRT)是一種存在于內質網(endoplasmic reticulum，ER)[19]及細胞膜、細胞質和細胞核[20]的多區域多功能性蛋白質，其最初是作為Ca2+結合伴侶分子被發現的[21]。CRT由三個不同的結構域組成，包括一個球形的N端結構域，此結構域含有內質網定位信號的序列；中間的P端結構域，是一個高親和力、低容量的Ca2+結合位點；一個強酸性的C端結構域，具有高容量、低親和力的Ca2+結合功能。C端包含一個KDEL序列，含有KDEL序列的蛋白可從高爾基體回到內質網。CRT可與其他內質網相關蛋白(特別是鈣連接蛋白)協作干預，以確保蛋白質和糖蛋白的正確折疊。鈣網蛋白與鈣聯接蛋白具有結構同源性，并具有與鈣聯接蛋白循環相關的功能：即在N聚糖依賴性的蛋白質質量控制過程中確保糖蛋白正確的折疊、降解和防止蛋白聚集[22]。

2013年12月，Nangalia等[23]和Klampf等[24]同時報道了在JAK2和MPL陰性的ET與PMF患者中發現CRT基因的異常突變，其比例占到60%～80%；至此，JAK2，MPL和CRT陰性(三陰性)的ET和PMF比例患者降低至15%以下。CRT的突變表現為：位于9號外顯子的插入和缺失，包括52 bp的缺失(Ⅰ型，占所有病例的45%～53%)，和5 bp TTGTC的插入(Ⅱ型，占所有病例的32%～41%)。突變可引起移碼，導致一個36個氨基酸序列取代正常C端序列中的27個氨基酸序列，形成了一個新的C末端，導致KDEL序列丟失。

在正常造血過程中，有關CRT突變介導的功能改變的相關報道很少，因此CRT突變是如何參與MPN的發生發展過程的在很大程度上仍然是未知的。但可以肯定的是，CRT突變導致MPN的關鍵致病因素與JAK/STAT信號有關，Klampfl等[24]研究表明，在白介素Ⅲ依賴性的鼠Ba/F3細胞中CRT del52的表達與STAT5磷酸化的增強相關，并使正常細胞轉化為非細胞因子依賴性細胞；此外，JAK2抑制劑可抑制CRT突變細胞的生長，且體外觀察與已報導的JAK2抑制劑治療CRT突變的MPN患者的結果相吻合[25]，其原因可能與細胞內CRT執行多種細胞功能有關。雖然通過CRT突變導致的JAK/STAT信號是異常復雜，但據現有研究表明在MPN中，CRT的突變與細胞功能紊亂具有相關性。

突變的CRT的C端缺乏KDEL序列，增加了細胞錯誤定位的可能性，從而引起細胞功能的改變。關于突變CRT結構功能關系的生物信息學分析表明，突變的蛋白質的C端失去結合Ca2+的能力，而這又可影響各種細胞功能[26]。此外，CRT/鈣聯接蛋白的缺陷也可能參與了造血祖細胞譜系的改變，導致巨核細胞譜系的優先擴增[27]。在內質網外野生型CRT定位于細胞質、細胞核、細胞表面及細胞外液。然而，來自于骨髓增生異常綜合征患者的白血病祖細胞和發育異常的祖細胞顯示，CRT在細胞表面上表達上調；CRT表達在細胞膜上可能釋放出一個“吞噬我”的信號，最終被CD47的表達所抵消，從而影響對腫瘤細胞的吞噬作用[28]。然而，在CRT突變的粒細胞，其在細胞表面的CRT含量并沒有顯著增加[23]。

CRT突變引起的ET和PMF使得MPN的發病機制的研究又向前跨越了一步，CRT使得ET和PMF的可檢測性超過85%，CRT突變的發現可顯著地影響MPN的實驗研究、患者的診斷和管理、預后及治療方式等。既然2008年WHO修訂MPN的分類診斷標準時，將JAK2和MPL的突變作為其主要標準[18]。因此，WHO有理由將CRT突變也納入MPN的診斷依據，與JAK2突變及MPL突變一起制定新的MPN診斷標準，并以CRT突變為突破點研發CRT抑制劑來治療CRT突變引起的MPN。

4 展望

JAK2突變的發現使Ph染色體陰性的MPN上升到分子診斷和分子靶向治療的層面[29]。MPL和CRT突變的發現使得MPN的診斷在JAK2突變的基礎上得以完善。隨著對它們在MPN中發病機制的深入了解將有助于患者的分型診斷，從而針對這些特異性分子標記物開發出特異性靶向治療藥物，以改進當前的治療方案，改善患者的預后及生存率。然而，現已對MPN發病的分子機制有了足夠的了解，但有些機制還不盡完善，更有少于15%的MPN患者可能存在的基因突變和表觀遺傳學改變尚不明確；針對JAK2、MPL、CRT等分子水平異常的靶向治療藥物的開發以及藥物療效的確定，尚待下一步深入研究。

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Research development of the relationship between gene mutation and myeloproliferative neoplasms.

WANG Peng1,2,QIN Song1,2,LIU Chang-bai1,2,WANG Jun1,2,ZOU Li-li1,2.1.Translational Neuroscience&Neural Regeneration and Repair Institute/Institute of Cell therapy,People's Hospital of China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA;2.Hubei key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotheraph,Cell Therapy Research Institute,China Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei,CHINA

Myeloproliferative neoplasms(MPN)are a group of diseases characterized by increased proliferation of erythroid,megakaryocytic,or granulocytic cells.These disorders are caused by hyperproliferation of multiple hematopoietic lineages in the bone marrow.The Philadelphia-chromosome-negative classic chronic myeloproliferative neoplasms(MPN)include polycythemia vera(PV),essential thrombocythemia(ET),and primary myelofibrosis(PMF). Studies have found that the pathogenesis of PV,ET and PMF is closely related to a variety of gene mutations which including Janus kinase 2(JAK2),MPL and calreticulin(CRT).This paper focuses on the latest research progress of the relationship between gene mutations(JAK2,MPL and CRT)and MPN.

Myeloproliferative neoplasms;JAK2;MPL;Calreticulin

R733.3

A

1003—6350（2016）05—0774—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.030

2015-09-06)

國家自然科學基金（編號：81201766）；湖北省教育廳基金（編號：Q20151204）

鄒黎黎。E-mail:zoulili@ctgu.edu.cn；王君。E-mail;wjtianxiafox@163.com