原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF—α的表達

楊美霞　宋芳　趙紫薇

[摘要] 目的 研究TNF-α在原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜及絨毛組織中的表達水平及意義。 方法 應用免疫組織化學和圖像分析，分別對30例原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者（病例組）和30例正常妊娠者（對照組） 蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達進行定位和半定量分析。 結果 免疫組織化學結果顯示在蛻膜組織中，TNF-α蛋白表達于蛻膜細胞質內，絨毛組織中，TNF-α蛋白表達于細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細胞質內。蛋白含量測定結果顯示，病例組TNF-α蛋白表達高于對照組。 結論 病例組蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達的升高與原因不明復發(fā)性流產(chǎn)有關，TNF-α可能參與原因不明復發(fā)性流產(chǎn)的病理過程。

[關鍵詞] 原因不明復發(fā)性流產(chǎn)；TNF-α；蛻膜；絨毛

[中圖分類號] R714.21 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2015）24-78-03

[Abstract] Objective To study the expression of TNF-α in decidua and villi of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion （URSA）. Methods With immunohistochemical method and image analysis technology， the local and quantitative expression of TNF-α were detected and analyzed between the patients of URSA （case group） and the patients of normal induced abortion（control group）. Results Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytoplasm of decidua cells in decidua， Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytotrophoblast and synctiotrophoblast cells in villi. The expression of TNF-α protein in case group was distinctively higher than control group. Conclusion The increased expression of TNF-α in decidua and villi is related to URSA， TNF-α may take part in the pathologic process of URSA.

[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion； TNF-α； Decidua； Villi

原因不明復發(fā)性流產(chǎn)指排除所有已知引起流產(chǎn)原因、連續(xù)3次或3次以上的反復流產(chǎn)。臨床上復發(fā)性流產(chǎn)的病因較復雜，除了內生殖器官解剖異常、染色體異常、感染性疾病及環(huán)境因素外，仍有超過50%的患者病因不明 [1]。大量研究表明輔助T細胞Th1/Th2的平衡與妊娠結局有密切的關系[2-4]。TNF-α是一類主要由Th1細胞分泌的細胞因子，目前有關復發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中TNF-α變化的研究較多，但是關于原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α蛋白表達的報道較少，因此本研究應用免疫組織化學方法對原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α的蛋白表達進行定位和半定量分析，以探討原因不明復發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的免疫機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取30例2011年3月～2012年4月在包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者作為病例組，入選標準：年齡25～41歲，平均（32.0±1.2）歲。孕周6～12周。自然流產(chǎn)次數(shù)均≥2次。經(jīng)檢查排除內分泌、染色體、自身免疫、以及生殖道感染和生殖系統(tǒng)解剖結構等方面疾病后納入本次研究。選取30例同期就診于包頭醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，要求人工流產(chǎn)終止妊娠的正常早孕婦女作為研究對照組，入選標準：年齡在24～39歲，平均（30.4±0.2）歲。孕周6～10周。既往月經(jīng)周期規(guī)律，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，本次妊娠孕囊符合停經(jīng)時間，無陰道流血，胚胎發(fā)育正常。對照組和病例組于行人工流產(chǎn)時或自然流產(chǎn)發(fā)生24h內收集蛻膜及絨毛組織，生理鹽水沖洗組織后用4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，將蠟塊切為4～8μm厚的組織切片。

1.2 主要試劑

TNF-α多克隆抗體（兔抗人）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋，即用型SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學顯色

蛻膜和絨毛組織切片先行脫蠟和水化；滴加0.3% H2O2室溫孵育10min；將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復3min，使抗原的位點暴露出來；滴加正常山羊血清封閉液室溫20min；滴加一抗（1∶50的兔抗人TNF-α抗體工作液） 4℃過夜，用PBS代替一抗做陰性對照；加二抗后37℃孵育40min；加SABC后37℃孵育40min；于室溫DAB-H2O2顯色，顯微鏡下觀察，以控制反應時間；蘇木素輕度復染細胞核；脫水，透明，封片后鏡下觀察。

1.4 圖像分析

選取對照組（30例）和病例組（30例）中每例蛻膜組織切片2張、絨毛組織切片2張，在蛻膜組織的蛻膜細胞、絨毛組織的合體滋養(yǎng)層細胞、細胞滋養(yǎng)層細胞分別隨機選取2個單位面積，應用捷達801圖像分析系統(tǒng)進行分析測量平均光密度。endprint

1.5 統(tǒng)計學處理

本研究以對照組和病例組平均光密度作為計量資料，采用SPSS17.0軟件的測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，組間進行t檢驗，計算平均值與標準差，計量數(shù)據(jù)用（）的形式表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的組織學定位

在子宮蛻膜組織中， TNF-α蛋白主要定位于蛻膜細胞的細胞質內，呈棕黃色顆粒，兩組陽性反應強弱不等（圖1A、B），兩組的腺上皮細胞內均未見表達。在絨毛組織中，病例組和對照組均可在合體滋養(yǎng)層細胞和細胞滋養(yǎng)層細胞質內見到棕黃色陽性反應顆粒（圖1C、D）。

2.2 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的半定量結果

病例組的蛻膜組織和絨毛組織中TNF-α蛋白含量均高于對照組，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

隨著免疫學和分子生物學的快速發(fā)展，復發(fā)性流產(chǎn)病因的免疫學說日益受到重視。Th1/Th2型細胞因子的平衡與妊娠結局有很大關系。正常情況下，妊娠表現(xiàn)為一種特殊的Th2現(xiàn)象，Th1處于一種抑制狀態(tài)，當發(fā)生向Th1型細胞因子過度表達時，將導致流產(chǎn)發(fā)生[5-6]。

TNF-α是一類主要由Th1細胞分泌的細胞因子，適量的TNF-α在妊娠早期可調節(jié)細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細胞的正常增殖、分化、凋亡，助于蛻膜細胞外基質降解及胎盤植入，利于能量代謝和胚胎發(fā)育，促進孕激素和絨毛促性腺激素的生成，對正常妊娠的維持和分娩的發(fā)動發(fā)揮重要作用[7-9]。黃江寧、鈄曉珍等[10-11]檢測到復發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中TNF-α水平較健康早孕婦女明顯升高，國內關于TNF-α蛋白在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜和絨毛組織中的定位及半定量表達情況的研究報道還較少，因此本研究采用免疫組織化學方法從蛋白質水平檢測不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達情況。

高艷霞等[12]研究顯示TNF-α主要表達于絨毛滋養(yǎng)層細胞內，在蛻膜細胞內無表達，而本研究檢測到絨毛滋養(yǎng)層細胞和蛻膜細胞內均有TNF-α表達。結果顯示在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達相對含量明顯高于正常早孕婦女，這與Smith等[13]的研究結果一致，提示復發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α的高表達與流產(chǎn)相關。高濃度的TNF-α 可能與細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細胞中的TNF-α受體結合從而限制細胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層的生長發(fā)育，導致早期胚胎的營養(yǎng)供給和吸收，不利于胚胎著床和妊娠維持。孫燕[14]等研究表明TNF-α能通過激活肥大細胞而損壞母體子宮蛻膜內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，致使胚胎停育。Clark等[15]研究表明在母胎界面TNF-α表達增加時對促凝血酶原激酶Fg12的表達有上調作用，使胎盤滋養(yǎng)血管纖維素沉積、血栓形成乃至胎盤梗死 [16]，說就證明高表達的TNF-α是通過多種途徑導致流產(chǎn)發(fā)生的。

綜上所述，TNF-α蛋白在母胎界面的高表達與原因不明復發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有密切關系，為該病發(fā)病免疫學說提供了證據(jù)。由于引發(fā)復發(fā)性流產(chǎn)的免疫機制極其復雜，因此TNF-α在復發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用機制還需進一步多方面深入研究。

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（收稿日期：2015-10-15）endprint