Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義

霍占江，李偉，高飛

（1.張家口市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 張家口 075061；2中國人民解放軍第251醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000；3.中國人民解放軍第251醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義

霍占江1，李偉2，高飛3

（1.張家口市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 張家口 075061；2中國人民解放軍第251醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000；3.中國人民解放軍第251醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

目的 探討Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法收集2005年1月至2010年12月期間在張家口市第一人民醫(yī)院和中國人民解放軍251醫(yī)院耳鼻喉科住院患者70例，手術(shù)病理活檢均明確診斷為鼻咽癌。應(yīng)用免疫組織化學(xué)(EnVisionTM)法分別檢測Wee1、Noxa蛋白在70例鼻咽癌組織和30例正常組織中的表達(dá)，R×C列表卡方法分析其表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，同時(shí)Spearman法分析兩蛋白之間的相關(guān)性。結(jié)果Wee1蛋白在鼻咽癌組織、正常組織中的陽性表達(dá)率分別為52.86%(37/70)、10.00%(3/30)，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.07，P＜0.01)；Noxa蛋白在鼻咽癌組織、正常組織中的陽性表達(dá)率分別為38.57%、63.33%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.18，P＜0.05）；Wee1、Noxa蛋白的表達(dá)均與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤?quán)徑M織及EBV感染有關(guān)(P＜0.05)，與性別、年齡、組織學(xué)類型及腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)。Wee1蛋白與Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.72，P＜0.01)。結(jié)論Wee1蛋白的高表達(dá)和Noxa蛋白低表達(dá)參與了鼻咽癌的發(fā)生，兩者的異常表達(dá)補(bǔ)充了鼻咽癌發(fā)生的相關(guān)機(jī)制。

鼻咽癌；Wee1；Noxa

鼻咽癌是鼻咽部最常見的惡性上皮源性腫瘤，其發(fā)病病因還未完全闡明，但認(rèn)為其與EB病毒感染、化學(xué)致癌物質(zhì)及遺傳因素等有關(guān)。EB病毒主要感染人類口咽部上皮細(xì)胞，體外可誘導(dǎo)人胚鼻咽上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生部分轉(zhuǎn)化，生長速度加快[1]。細(xì)胞的生長受細(xì)胞周期及其他因素的調(diào)控，而Wee1蛋白在細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變中具有重要的調(diào)節(jié)作用，其功能的異常影響細(xì)胞的增殖或凋亡。不僅如此，Noxa蛋白作為細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，其在維持細(xì)胞正常功能方面具有重要作用。目前，有關(guān)Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的相關(guān)研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)主要探討Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌形成中的作用及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，并進(jìn)一步分析兩者蛋白之間可能存在的聯(lián)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2005年1月至2010年12月期間在張家口市第一人民醫(yī)院和中國人民解放軍第251醫(yī)院住院患者資料70例，手術(shù)病理活檢明確診斷為鼻咽癌；男性37例，女性33例；患者年齡18～83歲，中位數(shù)年齡46歲，其中≥46歲者41例，＜46歲者29例；腫瘤直徑≥3 cm者39例，＜3 cm者31例；腫瘤部位：側(cè)壁25例，咽隱窩34例，上側(cè)壁11例；組織學(xué)類型：角化性鱗狀細(xì)胞癌9例，非角化性分化型癌32例，非角化性未分化型癌29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例；浸潤?quán)徑M織者38例，無浸潤?quán)徑M織者32例；EBV陽性者36例，EBV陰性者34例。同時(shí)選取癌旁正常組織30例作為對照組。

1.2 試劑和方法 即用型兔抗人Wee1單克隆抗體及其配套試劑盒、DAB顯色劑均由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供。濃縮型鼠抗人單克隆抗體Noxa及其配套試劑盒、DAB顯色劑由武漢博士德生物技術(shù)有限公司提供，抗體工作濃度按1:200稀釋。免疫組化染色均采用EnVision兩步法，操作步驟參照各自試劑盒說明書。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 Wee1著色于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，可表現(xiàn)為淺黃色、棕黃色、棕褐色。計(jì)數(shù)高倍鏡視野下每張切片著色的細(xì)胞，判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]。染色結(jié)果由兩名以上病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲評估，并建議-和+標(biāo)為低表達(dá)，記為陰性；++和+++標(biāo)為高表達(dá)，記為陽性。Noxa蛋白陽性著色于細(xì)胞質(zhì)，可表現(xiàn)為淺黃色、黃色、棕黃色。判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：計(jì)數(shù)10個高倍視野下陽性著色細(xì)胞所占百分比：陽性細(xì)胞≤5%為陰性，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；染色強(qiáng)度：0分為無色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色。上述兩項(xiàng)相乘1～4分(+)，5～8分(++)，9～12分(+++)。染色結(jié)果由兩名以上病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲評估，并規(guī)定總分≤4分均記為陰性，＞4分均記為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS17.0處理相關(guān)數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多個率之間的比較采用R×C χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌組織和正常黏膜組織中的表達(dá) Wee1蛋白著色于細(xì)胞核，在70例鼻咽癌組織中陽性表達(dá)37例，陽性率為52.86%；在30例正常組織中陽性表達(dá)3例，陽性率為10.00%，兩組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.07，P=0.00)；Noxa蛋白著色于細(xì)胞質(zhì)，在70例鼻咽癌組織中陽性表達(dá)27例，陽性率為38.57%；在30例正常組織中陽性表達(dá)19例，陽性率為63.33%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.18，P=0.02)，見圖1～圖4。

圖1 Wee1蛋白在鼻咽癌組織陽性表達(dá)(EnVision×100)

圖2 Wee1蛋白在黏膜慢性炎組織中陰性表達(dá)(EnVision×100)

圖3 Noxa蛋白在鼻咽癌組織陰性表達(dá)(EnVision×100)

圖4 Noxa蛋白在正常黏膜組織中陽性表達(dá)(EnVision×100)

2.2 Wee1、Noxa蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系 Wee1、Noxa蛋白的表達(dá)均與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤?quán)徑M織及EBV感染有關(guān)(P＜0.05)，而與患者性別、年齡、組織學(xué)類型及腫瘤部位無關(guān)(P＞0.05)，見表1。

2.3 鼻咽癌組織中Wee1、Noxa蛋白表達(dá)的相關(guān)性 70例鼻咽癌組織中，Wee1蛋白陽性表達(dá)且Noxa蛋白也陽性表達(dá)為2例，Wee1蛋白陰性表達(dá)且Noxa蛋白也陰性表達(dá)為8例；Wee1陽性表達(dá)而Noxa陰性表達(dá)為35例，Wee1陰性表達(dá)而Noxa陽性表達(dá)為25例。數(shù)據(jù)經(jīng)分析顯示，Wee1、Noxa蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.72，P=0.00)，見表2。

表2 Wee1、Noxa蛋白的表達(dá)與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系

表3 鼻咽癌組織中Wee1、Noxa蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

人Wee1基因位于11p15.3～11p15.1，編碼分子量為94 kD、含有647個氨基酸的蛋白。Wee1蛋白激酶作為G2/M期檢查點(diǎn)的關(guān)鍵激酶而特異性地參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，其表達(dá)的異常都會影響細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)變，進(jìn)而改變細(xì)胞的生物功能。Pappano等[4]認(rèn)為，Wee1在正常細(xì)胞生長情況下起著腫瘤抑制基因的作用，但在腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，特異性抑制Wee1不利于無p53活性的腫瘤增殖和生存。呂慧等[5]發(fā)現(xiàn)，Wee1蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯高于肝硬化及正常肝組織，不僅如此，肝細(xì)胞癌中Wee1蛋白表達(dá)越高，其分化程度越低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Wee1蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且其表達(dá)與鼻咽癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤?quán)徑M織及EBV感染有關(guān)。這說明癌細(xì)胞異常高表達(dá)Wee1蛋白不僅增加了癌細(xì)胞的增殖抗凋亡能力，而且也有利于癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。同時(shí)，與EBV感染之間的關(guān)系也顯示出，EBV感染陽性組中的Wee1蛋白表達(dá)明顯高于對應(yīng)組，這提示EBV有可能上調(diào)了Wee1蛋白，進(jìn)而促進(jìn)了病變的發(fā)生。

Noxa是Bcl-2家族成員之一，其含有1個BH3結(jié)構(gòu)域，通過此結(jié)構(gòu)域活化線粒體途徑進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。董偉等[3]研究發(fā)現(xiàn)，Noxa蛋白在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，其表達(dá)與胃癌組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，且Noxa蛋白表達(dá)陰性的胃癌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯低于表達(dá)陽性者。可見，Noxa蛋白在胃癌組織存在異常表達(dá)，其表達(dá)水平不利于胃癌的發(fā)生、發(fā)展。謝奇朋等[6]通過依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃腺癌細(xì)胞中Noxa表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)在4 h即開始明顯增加，8 h達(dá)到高峰，48 h胃腺癌細(xì)胞凋亡達(dá)50%，這提示依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞發(fā)生的凋亡與Noxa表達(dá)上調(diào)有關(guān)。也有研究顯示，轉(zhuǎn)染Noxa基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制和凋亡明顯高于對照組，同時(shí)細(xì)胞DNA合成受到抑制，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Noxa蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，且其表達(dá)與鼻咽癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤?quán)徑M織及EBV感染有關(guān)。這說明癌細(xì)胞異常低表達(dá)Noxa蛋白增加了癌細(xì)胞的抗凋亡能力，也有利于癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移，并且，EBV感染陽性組中的Noxa蛋白表達(dá)明顯低于對應(yīng)組，這提示EBV有可能下調(diào)了Noxa蛋白，促進(jìn)了癌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制了癌細(xì)胞的增殖。

盡管Wee1和Noxa蛋白均與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤?quán)徑M織及EBV感染有關(guān)，但兩者的表達(dá)水平卻相反，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，鼻咽癌組織中Wee1和Noxa蛋白表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。同時(shí)，EBV感染陽性組癌細(xì)胞高表達(dá)Wee1蛋白及低表達(dá)Noxa蛋白，這說明EBV可誘導(dǎo)上調(diào)Wee1蛋白表達(dá)及下調(diào)Noxa蛋白表達(dá)，然而它們之間的信號調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]楊靜,唐發(fā)清,顧煥華,等.EB病毒介入鼻咽上皮細(xì)胞永生化早期階段的生物學(xué)觀察[J].實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào),2001,34(2):89-99.

[2]Magnussen GL,Hellesylt E,Nesland JM,et al.High expression of wee1 is associated with malignancy in vulvar squamous cell carcinoma patients[J].BMC Cancer,2013,13(288):1-9.

[3]董偉,魏志,孫自勤,等.凋亡蛋白Bad與Noxa在胃癌中表達(dá)及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2014,28(7):636-640.

[4]Pappano WN,Zhang Q,Tucker LA,et al.Genetic inhibition of the atypical kinase Wee1 selectively drives apoptosis of p53 inactive tumor cells[J].BMC Cancer,2014,14(430):1-11.

[5]呂慧,楊玉秀,張立達(dá),等.Wee1與肝癌的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2011,19(14):1515-1519.

[6]謝奇朋,葉艷,郝延璋,等.bcl-2家族BH3-only蛋白在依托泊苷誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡中的作用[J].腫瘤防治研究,2006,33(7): 502-505.

[7]趙志,吳愛國,沈三弟.Noxa基因轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用[J].腫瘤防治研究,2010,37(10):1104-1108.

Expression of Wee1 and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance.

HUO Zhan-jiang1,LI Wei2,GAO Fei3.1.Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,the First People's Hospital of Zhangjiakou City, Zhangjiakou 075061,Hebei,CHINA;2.Department of Pathology,the 251thHospital of PLA,Zhangjiakou 075000,Hebei, CHINA;3.Department of Intensive Care Unit,the 251thHospital of PLA,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Wee1 and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance.MethodsA total of 70 cases of nasopharyngeal carcinoma,who were definitely diagnosed as nasopharyngeal carcinoma by surgery pathology biopsy in the First People's Hospital of Zhangjiakou City and the 251thHospital of PLA from January 2005 to December 2010,were selected as the subjects.Expressions of Wee1 and Noxa protein were detected by immunohistochemistry(EnvisionTM)in 70 cases of nasopharyngeal carcinoma and 30 cases of normal tissue.The relationship between expressions of Wee1 and Noxa protein and clinical factor was analyzed by RxC χ2test,and the correlation between Wee1 and Noxa protein was analyzed by Spearman's rank correlation.ResultsThe positive expressions rate of Wee1 protein in nasopharyngeal carcinoma tissues[52.86%(37/70)] was significantly higher than that in normal tissues[10.00%(3/30)],χ2=16.07,P＜0.01,while the positive expression rate of Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma tissues[38.57%(27/70)]was significantly lower than that in normal tissues[63.33%(19/30)],χ2=5.18,P＜0.05.The expressions of Wee1 protein and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma tissues were related to tumor size,lymph node metastasis,infiltrating adjacent tissues and EBV infection(P＜0.05),but not related to gender,age,histological category and tumor site(P＞0.05).The expression of Wee1 protein in nasopharyngeal carcinoma tissue was negative correlation with the expression of Noxa protein(r=-0.72,P＜0.01).ConclusionThe overexpression of Wee1 protein and low expression of Noxa protein take part in the development of nasopharyngeal carcinoma,and their abnormal expression may be supplements for the mechanism of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal carcinoma;Wee1;Noxa

R739.63

A

1003—6350（2016）11—1776—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.018

2015-12-12)

李偉。E-mail：liwei-324@163.com