晚期非小細胞肺癌中上皮細胞間質轉型和表皮生長因子受體的檢測及其相關性研究

柴春香，王曉敏，郭文君，孫永紅（濰坊醫學院附屬醫院.醫務科，.病理科，山東濰坊6000）

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晚期非小細胞肺癌中上皮細胞間質轉型和表皮生長因子受體的檢測及其相關性研究

柴春香1，王曉敏2，郭文君2，孫永紅2
（濰坊醫學院附屬醫院1.醫務科，2.病理科，山東濰坊261000）

摘要：目的探討非小細胞肺癌（NSCLC）中上皮細胞間質轉型（EMT）與表皮生長因子受體（EGFR）的相關性。方法免疫組織化學法（EnVision）檢測78例晚期NSCLC組織和16例正常肺組織中的EGFR、E-鈣黏素（E-cadherin）和波蛋白（Vimentin）的表達。EGFR 18～21號外顯子聚合酶鏈反應（PCR）擴增及基因測序。結果78例NSCLC中，EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC中陽性表達率分別為61.5%（48/78）、43.6% （34/78）和56.4%（44/78），EGFR基因突變率為24.4%（19/78），正常組為陰性。EGFR野生型組的EMT發生率高（67.8% vs 21.1%），EGFR蛋白與EMT呈正相關性（r=0.236，P=0.037）。結論E-cadherin降低或全部丟失及EGFR通過信號傳導通路可以促進EMT的發生。

關鍵詞：晚期非小細胞肺癌；上皮細胞間質轉型；表皮生長因子受體

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是目前較常見的腫瘤相關死亡原因，晚期NSCLC患者發生淋巴結或遠處轉移，治療效果及預后較差。腫瘤細胞的侵襲性是腫瘤轉移主要因素之一，研究表明，上皮細胞間質轉型（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細胞侵襲過程中起重要作用，EMT的發生與多種蛋白分子和信號傳導通路有關，以E-鈣黏素（E-cadherin）表征上皮型指標蛋白的喪失以及波蛋白（Vimentin）表征間質型指標蛋白的獲得為主要特征。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導的信號傳導通路在NSCLC的研究中較熱門，尤其是基因檢測及靶向治療中的應用價值被廣泛認可。本實驗對78例發生轉移的晚期NSCLC患者腫瘤組織中EGFR進行基因測序，E-cadherin、Vimentin和EGFR蛋白進行免疫組織化學法檢測，分析3者在晚期NSCLC中的臨床意義及內在聯系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2010年1月-2013年1月在濰坊醫學院附屬醫院行穿刺或支氣管鏡活檢的晚期NSCLC患者的腫瘤組織。根據2009年第七版的肺癌TNM分期標準，78例患者臨床分期為Ⅳ期（包括淋巴結及遠處轉移）。其中，男性54例，女性24例；年齡＜60 歲30例，≥60歲48例，平均62.5歲；有吸煙史52例，無吸煙史26例；肺腺癌57例，鱗癌21例。正常肺組織標本16例作為對照組。

1.2方法

將NSCLC組織行石蠟包埋，4μm厚度切片，蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色。

1.2.1DNA提取和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，RT-PCR）石蠟切片的DNA提?。孩賹?～10個切片10 000 r/min離心1 min，加入250ul Buffer TL收集管A，90℃孵育1h。②室溫放置1min，12 000 r/min離心2 min，移液器吸取200μl組織液體至1.5ml收集管B中，加入20μl Omega Business蛋白酶（蛋白酶K 20 mg/ml），55℃水浴，過夜消化。③加入250μl Buffer BL于過夜消化的液體中，加入4μl助沉劑，70℃水浴箱內水浴10 min，期間進行DNA吸附柱平衡準備。④DNA吸附柱中純化，洗脫液體，循環2次。將吸附柱裝至新的無菌Eppendorf管中，加入70℃預熱的Elution Buffer，靜置＞3 min，12 000 r/min離心2 min。對提取的DNA進行質量鑒定。PCR擴增EGFR 18～21號外顯子。將PCR產物送至大連寶生生物工程有限公司進行測序，并將測序結果與正常基因序列進行比對分析。1.2.2免疫組織化學（EnVision）法常規脫蠟至水，抗原修復處理，滴加一抗（EGFR、E-cadherin、Vimentin），37℃培養箱孵育45 min，滴加二抗（K5007），二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化，自來水反藍，脫水透明，中性樹脂封固。陽性對照采用北京中杉生物科技有限公司提供的陽性片，陰性對照采用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）液代替一抗。判讀方法：陽性為細胞出現棕黃色顆粒，陰性為無顯色。E-cadherin、Vimentin和EGFR陽性著色在細胞膜和/或細胞漿。根據其染色程度及細胞數量進行染色評分判讀，陽性細胞評分法：陰性為0分，陽性細胞比例＜25%為1分，陽性細胞比例25%～50%為2分，陽性細胞比例51%～75%為3分，陽性細胞比例＞75%為4分。細胞染色程度評分法：腫瘤細胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。上述兩項之和即為腫瘤細胞的染色評分，總分0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～6分為陽性（++），7～12分為強陽性（+++）。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，率的比較用χ2檢驗，1≤T＜5時，采用校正公式；相關性分析采用Spearman相關性分析，P＜0.05為差異統計學意義。

2　結果

2.1EGFR、E-cadherin和Vimentin在NSCLC組織中的表達

78例NSCLC患者基因突變率為24.4% （19/78）。EGFR、E-cadherin和Vimentin陽性表達率分別為61.5%（48/78）、43.6%（34/78）和56.4% （44/78），78例患者的EMT發生率為56.4%。16例正常肺組織EGFR、E-cadherin和Vimentin為陰性。見圖1～8和表1。

2.2NSCLC組織中EGFR和EMT的表達及其與臨床病理因素的相關性

78例NSCLC患者中，腺癌EGFR基因突變率高于鱗癌（50% vs 0%），經假設檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），EGFR基因突變與年齡、性別及吸煙史無關（P＞0.05）。鱗癌患者EGFR陽性表達率（81%）高于腺癌患者（54.4%），經假設檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），與患者的性別、年齡及吸煙史無關（P＞0.05）。男性EMT發生率（66.7%）高于女性（33.3%），經假設檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；EMT發生率與組織類型、吸煙史及年齡無關（P＞0.05）。見表2。

圖1　E-cadherin在NSCLC腫瘤細胞膜和細胞漿中表達（EnVision×200）

圖2　Vimentin陰性（EnVision×200）

圖3　Vimentin在NSCLC腫瘤細胞漿中表達（EnVision×200）

圖4　E-cadherin陰性（EnVision×200）

圖5　外顯子19雜合缺失突變（DelL747-S752）正向測序圖

圖6　外顯子19雜合缺失突變（DelL747-S752）反向測序圖

圖7　外顯子21 858密碼子雜合點突變（CTG>CGG）正向測序圖

圖8　外顯子21 858密碼子雜合點突變（CTG>CGG）反向測序圖

2.3EGFR基因型與晚期NSCLC中EMT的相關性

晚期NSCLC存在EGFR基因突變的EMT發生率（21.1%）明顯低于無EGFR基因突變的EMT發生率（67.8%），差異有統計學意義（P =0.000）。

表1　EGFE和EMT在晚期NSCLC及正常肺組織中的表達例

表2　臨床病理因素與晚期NSCLC組織中EGFE和EMT表達的相關性例

2.4EGFR蛋白與NSCLC中EMT的相關性

Spearman秩和相關性分析顯示，78例晚期NSCLC組織中44例發生EMT，其中32例EGFR陽性表達，12例EGFR陰性表達；34例未發生EMT的晚期NSCLC患者中，20例EGFR陽性表達，14例EGFR陰性表達。對EMT和EGFR的表達狀態進行Spearman相關性分析，結果顯示兩指標有相關性（r=0.236，P =0.037）。

3　討論

EMT是上皮細胞在與周圍間質的相互作用過程中，逐漸獲得某些間質細胞特有性狀的現象，以E-cadherin陽性、Vimentin陰性為表征上皮型；以E-cadherin陰性、Vimentin陽性為表征間質型。Hazan等[1]報道，E-cadherin及Vimentin細胞膜或細胞漿染色與Western blot檢測結果有較好的一致性，免疫組織化學法結果可以表征EMT狀態。EMT的發生涉及信號轉導通路和上皮表型蛋白丟失[1]，因此，本實驗通過分析EMT與EGFR的相關性，初步探討EGFR信號轉導能否誘導EMT的形成。

78例NSCLC患者中EGFR基因突變率為24.4%（19/78），腺癌高于鱗癌，差異有統計學意義（P＜0.05），EGFR突變與吸煙及性別無關（P＞0.05）。國內報道，中國人EGFR突變率為19.2%～33.3%[2-4]。EGFR蛋白在許多腫瘤中過表達，在肺癌的表達率為53%～69%，其與腫瘤的生長、侵襲和轉移密切相關[5]，在本實驗中，NSCLC組織中EGFR蛋白陽性表達率為61.5%（48/68），腺癌的患者EGFR陽性表達率低于鱗癌患者（P＜0.05），與患者的性別、年齡及吸煙史無關，與Pastorino等[6]EGFR蛋白在鱗癌中過表達發生率較高的觀點相同。

本研究采用免疫組織化學法檢測NSCLC中E-cadherin和Vimentin的表達，陽性率分別為43.6%和56.4%。本研究發現，男性EMT發生率高于女性，差異有統計學意義（P＜0.05），國內部分文獻報道，E-cadherin和Vimentin的表達與患者年齡、性別、組織類型及TNM分期無關[7-8]，但有待提高樣本量進一步分析。E-cadherin和Vimentin的表達具有較好的一致性。本實驗中EMT的發生率為56.4%，較田茗源等[9]的實驗數據偏高，筆者分析與本研究對象為晚期NSCLC患者有關，腫瘤發生轉移，說明EMT與NSCLC腫瘤細胞發生原位侵襲和遠處轉移密切相關。研究進一步證實來源于上皮組織的惡性腫瘤中E-cadherin降低或全部丟失，Vimentin表達升高，細胞間的粘附力降低，從而促進腫瘤組織發生EMT。

很多細胞外信號的生長因子與EMT的發生相關，如HGF、EGF、VEGF等，可以通過不同的信號傳導途徑誘導發生EMT[10-11]，Voon等[12]提出EMT誘導胃干細胞分化和促進腫瘤發生與EGFR信號轉導通路有關。本實驗結果顯示，78例NSCLC組織中EGFR表達與EMT發生相關（P＜0.05）。在細胞水平上，EGFR和E-cadherin共同存在于細胞間的黏著小帶，與β-catenin相連。當EGFR過表達，與細胞外的配體結合，受體自身的酪氨酸發生磷酸化，使E-cadherin從肌動蛋白絲上解離下來，細胞間的黏附力下降，促使腫瘤發生EMT。鄧沁芳等[13]研究發現，EGFR突變患者的NSCLC上皮表型高于EGFR未突變患者（77.7% vs 18.2%，P＜0.05）。本研究結果與鄧沁芳等[13]的相反，筆者發現，晚期NSCLC存在EGFR基因突變的EMT發生率低于無EGFR基因突變的EMT發生率（P＜0.05）。筆者分析，EGFR發生基因突變時其介導的信號通路與誘導EMT發生的能力減弱。

本實驗可以得出，E-cadherin降低或全部丟失及EGFR通過信號傳導通路可以促進EMT發生。同時，聯合檢測EGFR和EMT的表型蛋白有利于判斷腫瘤的惡性程度，為臨床治療及預后提供更有效的依據。預測EMT的發生受EGFR基因突變的影響，突變型患者腫瘤不易發生EMT，而野生型患者易出現間質型轉化，其作用機制有待進一步研究。

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（童穎丹編輯）

Relationship between EGFR and EMT in advanced non-small cell lung cancer

Chun-xiang Chai1, Xiao-min Wang2, Wen-jun Guo2, Yong-hong Sun2
(1. Medical Department, 2. Department of Pathology, the Affilited Hospital of
Weifang Medical University, Weifang, Shandong 261000, China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of epithelial-mesenchymal transition (EMT) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods Immunohistochemistry (EnVision method) was used to detect the expressions of EGFR, E-cadherin and vimentin. Exons 18-21 of EGFR were detected by PCR and gene sequencing. Results The positive expression rate of EGFR, E-cadherin and vimentin was 61.5% (48/78), 43.6% (34/78), 56.4% (44/78) respectively in the 78 cases of NSCLC; while they were not expressed in the normal group. The mutation rate of EGFR gene was 24.4%(19/78) in the NSCLC group. The incidence of EMT was higher in the EGFR wild-type group than in the mutation group (67.8% vs 21.1%). There was a positive correlation between EGFR protein expression and EMT (r= 0.236, P= 0.037). Conclusions Lost E-cadherin and EGFR signaling pathways could promote the formation of EMT.

Keywords:non-small cell lung cancer; epithelial-mesenchymal transition; epidermal growth factor receptor

[通信作者]王曉敏，E-mail：wangxiaomin1986@sina.cn

收稿日期：2014-01-07

文章編號：1005-8982（2016）03-0034-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.03.007

中圖分類號：R734.2

文獻標識碼：A