盤狀紅斑狼瘡患者T淋巴細胞CD70基因的表達及臨床意義

葉筱燕，蒙秉新，張燕，蘇建英，丁艷，王玉文，王遠志

（1.海南省人民醫院皮膚科，海南 ?？?570102；2.海南省婦女兒童醫院皮膚科，海南 ?？?570206）

盤狀紅斑狼瘡患者T淋巴細胞CD70基因的表達及臨床意義

葉筱燕1，蒙秉新1，張燕1，蘇建英1，丁艷2，王玉文1，王遠志1

（1.海南省人民醫院皮膚科，海南 ?？?570102；2.海南省婦女兒童醫院皮膚科，海南 海口 570206）

目的 檢測盤狀紅斑狼瘡(DLE)患者外周T淋巴細胞CD70基因表達水平，并探討CD70基因在DLE發病機理中的作用。方法RT-PCR測定2014年1月至2015年6月在我院就診的15例活動期、15例非活動期DLE患者和同期健康體檢的15例健康人(對照組)外周血T淋巴細胞CD70 mRNA轉錄水平，流式細胞術檢測各組樣本中CD4+CD70+T/CD8+CD70+T的陽性率。結果活動期和非活動期DLE患者T淋巴細胞中的CD70 mRNA轉錄水平分別為(4.5±0.19)和(2.9±0.09)，顯著高于對照組的(1.9±0.11)，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)，且活動期DLE患者T淋巴細胞中的CD70 mRNA的轉錄水平明顯高于非活動期DLE患者，差異具有統計學意義(P＜0.05)；活動期和非活動期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴細胞的陽性率分別為(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明顯高于對照組的(14.63±0.41)%，差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，且活動期DLE患者的陽性率顯著高于非活動期DLE患者，統計有顯著統計學意義(P＜0.01)；活動期和非活動期DLE患者T淋巴細胞中CD8+CD70+的陽性率與對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。結論CD70基因的過度表達在DLE的發生發展中起著重要的作用，且CD70過度表達可作為檢測DLE疾病患者的一個重要指標。

盤狀紅斑狼瘡；T淋巴細胞；CD70基因；臨床意義

紅斑狼瘡(Lupus erythematosus，LE)是一種病譜性疾病，其有兩種亞型，分別為盤狀紅斑狼瘡(Discoid lupus erythematosus，DLE)以及系統性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)。DLE與SLE有許多相同的臨床表現，但是DLE普遍僅局限于皮膚，極少出現嚴重累及內臟器官的情況，而SLE患者經常累及心血管、腎臟、肺或中樞神經系統等[1]。目前對于DLE發病的基礎研究不夠充分，其具體機制尚不明確，臨床上至今仍缺乏有效的治療方法。

CD70是腫瘤壞死因子家族重要的成員[2]，是CD27的配體，普遍表達于活躍的CD4+和CD8+T細胞和B細胞上。現普遍認為CD70基因亦是狼瘡相關甲基化敏感基因[3-4]，CD27-CD70系統的紊亂導致一系列的免疫異常，據研究證實，CD27抗原是DLE疾病活動的一個重要標志，與疾病活動密切相關[5]。目前國內外對于這一方面的研究還很薄弱。本文通過研究活動期和非活動期DLE患者外周血T淋巴細胞CD4+和CD8+細胞中的CD70基因的分子表達水平，初步探討DLE的發病與CD70基因表達之間的關系，以期為進一步明確DLE在基因及分子水平的發病機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年6月在我院住院及門診就診的30例DLE患者，均符合DLE診斷標準的四項指標。其中活動期DLE 15例，女性13例，男性2例，平均年齡(26.8±5.7)歲；非活動期DLE 15例，男性1例，女性14例，平均年齡(25.5±6.2)歲；對照組15例，皆為本院體檢中心健康體檢者，家族中無自身免疫性疾病史，女性14例，男性1例，平均年齡(27.5±5.3)歲。各組受檢者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 試劑及其儀器 CD70：5'-TGCTTTGGTCCC ATTGGTCG-3'，5'-TCCTGCTGAGGTCCTGTGTGAT TC-3'(上海博亞生物技術有限公司)。QPCR反應儀為ABI 7500(ABI公司)；Real Time反應試劑盒(OMEGA公司)；逆轉錄試劑盒(Sigma公司)；總蛋白提取試劑盒(BestBio公司)；免疫磁珠(德國MiltenyiBiotec公司)；TRIZOL?試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(美國Pmmega公司)；抗人CD4/CD8單克隆抗體BD (美國BD公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 淋巴細胞細胞分離及其核酸抽提 各組樣本中取靜脈血30 mL(肝素抗凝)。采用淋巴細胞分離液常規分離方法分離外周血單核細胞。按說明書操作用免疫磁珠分離T淋巴細胞CD4+和CD8+細胞。用TRIZOL試劑按操作說明操作提取總RNA以及基因組DNA，檢測濃度及純度后，-20℃保存備用。

1.3.2 實時PCR及Western blot檢測CD70的表達 任取樣本中所提取的RNA逆轉錄成cDNA為模板。以l/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×對倍稀釋成五個梯度后作為模版DNA，并以CD70基因與β-肌動蛋白基因(內參照基因)的特異引物進行實時PCR，2個復孔。反應條件如下：50℃15 min，1個循環；95℃15 min，1個循環；94℃15 s，55℃30 s，40個循環；72℃30 s；內參基因為β-肌動蛋白：5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，5'-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3'。提取CD4+CD70+T淋巴細胞總蛋白，確定蛋白樣品的濃度后加入等量樣品到每個加樣孔，進行Western blot檢測，經曝光、顯影及定影后，統計目的條帶灰度值。

1.3.4 流式檢測T淋巴細胞中CD70 mRNA的轉錄水平 T淋巴細胞的檢測純度約為90%。從各組標本中分別取50 μL T淋巴細胞懸液于試管中，細胞濃度為l×106個細胞/mL，待2次洗滌后先固定細胞再加入已用FITC標記過的抗人CD70抗體，以及PE標記過的抗人CD4/CD8單克隆抗體，室溫下標記時間為30 min，經洗滌后每管中加入用含0.5%甲醛的磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻制成細胞懸液，然后以細胞測定數為5 000個左右的濃度上機檢測，計算出每份標本中CD4+CD70+細胞及CD8+CD70+細胞占T淋巴細胞的百分率。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組受檢者的CD70 mRNA表達水平比較如圖1所示，與對照組比較，活動期、非活動期DLE患者T淋巴細胞CD70 mRNA轉錄水平明顯提高，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)，且活動期DLE患者的轉錄水平顯著高于非活動期患者，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)?；顒悠?、非活動期DLE患者中T淋巴細胞CD4+細胞的CD70 mRNA轉錄水平，極顯著高于對照組(P＜0.01)?；顒悠贒LE患者T淋巴細胞CD4+細胞的CD70 mRNA的轉錄水平明顯高于非活動期DLE患者中的轉錄水平，差異具有統計學意義(P＜0.05)；活動期、非活動期DLE患者中T淋巴細胞CD8+的CD70 mRNA轉錄水平與對照組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

圖1 DLE患者與對照組T淋巴細胞中CD70 mRNA的水平比較

表1 DLE患者T淋巴細胞中CD70 mRNA的表達(±s)

表1 DLE患者T淋巴細胞中CD70 mRNA的表達(±s)

注：與對照組比較；aP＜0.01；與非活動期比較，bP＜0.05。

臨床特征CD70 mRNA水平(ΔCt值)t/F值P值年齡(歲)≤25＞25性別t=1.520.14 12.50±0.92 12.26±0.87 t=0.260.88男女12.34±0.90 12.36±0.91 CD4+對照組非活動期活動期CD8+對照組非活動期活動期F=5.65＜0.01 13.53±0.93 12.08±0.71a11.24±0.62abF=1.310.28 12.29±0.90 12.47±0.97 12.97±0.06

2.2 三組受檢者T淋巴細胞中CD70水平比較 活動期和非活動期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴細胞的陽性率分別為(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明顯高于對照組的(14.63±0.41)%，差異均有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，且活動期DLE患者的陽性率顯著高于非活動期DLE患者，統計有顯著統計學意義(P＜0.01)；活動期和非活動期DLE患者T淋巴細胞中CD8+CD70+的陽性率與對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見圖2。

圖2 流式檢測DLE患者與對照組中T淋巴細胞中CD70水平比較

2.3 CD4+CD70+T淋巴細胞CD70蛋白的Western blot檢測 與對照組比較，活動期、非活動期DLE患者CD4+T淋巴細胞的CD70基因平均表達水平均提高，差異均有統計學意義(P＜0.05)；活動期DLE患者中CD70基因的平均表達水平明顯高于非活動期DLE患者，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖3。

圖3 Western blot檢測CD4+CD70+T淋巴細胞CD70蛋白水平

3 討論

CD70是編碼腫瘤壞死因子的基因之一，主要在T細胞和B細胞上表達，其配體是CD27分子[6]。體外實驗的條件下處于未活化T淋巴細胞中CD70基因是很少表達的，但是處于變態反應或自身免疫反應等條件下，T淋巴細胞經刺激活化后可大量表達CD70蛋白[7]。作為T淋巴細胞的輔助/共刺激信號，CD70與CD27的結合可以對B細胞的激活進行調控[8]。

CD27-CD70的系統紊亂可引起機體的一系列免疫異常，CD27可以促進人B細胞分泌產生免疫球蛋白，且與漿細胞的分化增強有關[9]；CD70與CD27的結合可引起協同刺激信號促進B細胞分泌IgG抗體，使得狼瘡患者外周血中B淋巴細胞的異常表達以及促進產生依賴T細胞分泌的IgG[10-11]。因此CD70在B細胞異常活躍中的作用，可能與LE等疾病的發生密切相關。El-Mahdy等[12]研究表明，CD4+T經過甲基化抑制劑處理后，細胞會過度表達CD70，且過度表達的CD70又將刺激B細胞分泌IgG，并且抗CD70抗體阻斷能阻斷這種異常分泌，這些均為T細胞過度表達CD70蛋白進而有利于促進IgG分泌增加的假說提供了必要的實驗依據。

本研究結果表明，活動期和非活動期DLE患者中外周血T淋巴細胞CD4+細胞內CD70基因的轉錄和表達水平均明顯升高，但CD70基因并未在CD8+T淋巴細胞內出現表達上調，說明CD70確實在DLE的發病機和發展過程中存在差異表達的現象。本研究還發現T淋巴細胞中CD4+CD70+的細胞陽性率以及T淋巴細胞CD4+細胞內CD70 mRNA的轉錄水平與DLE疾病進展活動的程度表現出正相關的趨勢，因此T淋巴細胞中CD70分子轉錄和表達水平的高低可能可以成為衡量DLE疾病活動進展程度的又一個監測指標。

[1]Mak A,Isenberg DA,Lau CS.Global trends,potential mechanisms and early detection of organ damage in SLE[J].Nature Reviews Rheumatology,2013,9(5):301-310.

[2]Sekigawa I,Kawasaki M,Ogasawara H,et al.DNA methylation:its contribution to systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Med, 2006,6(3):99-106.

[3]丁艷,肖嶸,蒙秉新,等.CD70 mRNA及其蛋白在DLE患者T淋巴細胞中的表達[J].中國皮膚性病學雜志,2012,26(4):291-292.

[4]Tai X,Van Laethem F,Pobezinsky L,et al.Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventionalCD4(+)T cells[J].Blood,2012, 119(22):5155-5163.

[5] Puizina-Ivi N.Skin aging[J].Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat,2008,17(2):47-54.

[6] Bour-Jordan H,Esensten JH,Martinez-Llordella M,et al.Intrinsic and extrinsic control of peripheral T-cell tolerance by costimulatory molecules of the CD28/B7 family[J].Immunological Reviews, 2011,241(1):180-205.

[7]Conaghan PG,Durez P,Alten RE,et al.Impact of intravenous abatacept on synovitis,osteitis and structural damage in patients with rheumatoid arthritis and aninadequate response to methotrexate:the ASSET randomised controlled trial[J].Annals of the Rheumatic Diseases,2013,72(8):1287-1294.

[8]Denoeud J,Moser M.Role of CD27/CD70 pathway of activation in immunity and tolerance[J].Journal of Leukocyte Biology,2011,89 (2):195-203.

[9]Durandy A,Kracker S.Immunoglobulin class-switch recombination deficiencies[J].Arthritis Research and Therapy,2012,14(4):218.

[10]Salama AK,Hodi FS.Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 [J].Clinical Cancer Research,2011,17(14):4622-4628.

[11]Xu Z,Juan V,Ivanov A,et al.Affinity and cross-reactivity engineering of CTLA4-Ig to modulate T cell costimulation[J].Journal of Immunology,2012,189(9):4470-4477.

[12]El-Mahdy MA,Zhu Q,Wang QE,et al.Naringenin protects HaCaT human keratinocytes against UVB-induced apoptosis and enhances the removal of cyclobutane pyrimidine dimers from the genome[J]. Photochem Photobiol,2008,84(2):307-316.

Expression of CD70 in T lymphocytes from patients with discoid lupus erythematosus and its clinical significance.

YE Xiao-yan1,MENG Bing-xin1,ZHANG Yan1,SU Jian-ying1,DING Yan2,WANG Yu-wen1,WANG Yuan-zhi1. 1.Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,CHINA;2.Department of Dermatology, Maternal&Child Health Hospital of Hainan Province,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of CD70 in T lymphocytes of discoid lupus erythematosus (DLE)patients and the role of CD70 in DLE pathogenesis.MethodsBlood samples were obtained from 15 patients with active DLE,15 patients with unreactive DLE and 15 normal human controls from January 2014 to June 2015.Quantitative RT-PCR and flow cytometry were applied to detect the transcriptional level of CD70 mRNA and the positive rate of CD4+CD70+T/CD8+CD70+T cells respectively.ResultsThe levels of CD70 mRNA in T lymphocytes in active DLE(4.5±0.19)and non-active DLE group(2.9±0.09)were significantly higher than that in the normal control group (1.9±0.11)(P＜0.01).Moreover,the levels of CD70 mRNA in the active DLE group was significantly higher than that in non-active DLE group(P＜0.05).The positive rate of peripheral blood CD4+CD70+T cells in active DLE group [(18.82±1.22)%]and non-active DLE group[(15.32±1.01)%]were significantly higher than that in the normal control group[(14.63±0.41)%](P＜0.05,P＜0.01).The active DLE group showed higher positive rate than non-active DLE group (P＜0.01).However,there was no significant difference between the three groups in the positive rate of CD8+CD70+T cells(P＞0.05).ConclusionThis study shows that over-expression of CD70 plays a significant role in the pathogenesis of DLE and could be used as an important index of disease detection in patients with DLE.

Discoid lupus erythematosus;T lymphocytes;CD70 gene;Clinical significance

R593.24

A

1003—6350（2016）14—2243—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.003

2016-01-12)

海南省衛生廳衛生計生行業科研項目(編號：瓊衛2013自籌-33)

王遠志。E-mail：wangyuanzhi407@163.com