痰熱清聯用萬古霉素降低對MRSA的防耐藥突變濃度的體外研究

陳洋 張文平 佑航標 荊珊珊 馬利軍

痰熱清聯用萬古霉素降低對MRSA的防耐藥突變濃度的體外研究

陳洋 張文平 佑航標 荊珊珊 馬利軍

目的探討痰熱清聯用萬古霉素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的防耐藥突變濃度的影響。方法采用瓊脂二倍稀釋法測定萬古霉素單用以及聯合痰熱清MRSA的最低抑菌濃度(MIC)、防止耐藥突變濃度、選擇指數(SI)。結果萬古霉素、痰熱清對MRSA的防突變濃度(MPC)分別為1 μg/ml、500 μl/ml；聯合痰熱清時萬古霉素對MRSA的MPC為0.5 μg/ml。結論痰熱清聯合應用可降低單藥對MRSA的MPC,縮小SI,有效的防止耐藥菌的富集。

痰熱清；萬古霉素；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；防耐藥突變濃度

在抗感染治療領域正面臨著前所未有的挑戰,細菌耐藥狀況日益嚴峻,耐藥菌感染嚴重威脅著公眾健康。由于萬古霉素耐藥菌株的出現及腎毒性等副作用,給臨床治療帶來很大的困難。中草藥在治療細菌感染方面逐漸受到重視,具有抗菌作用的中藥制劑正不斷得到研究與證實,因此探究中藥對MRSA的抗菌效果是非常必要的。MPC和SI概念的提出對臨床應用抗菌藥物提出了新的要求,也為研究耐藥機制開辟了新的領域。研究體外測定痰熱清聯用不同濃度的萬古霉素對MRSA有不同程度的抑制作用,這為臨床上從中藥途徑解決MRSA耐藥性問題提供思路。通過協同治療,既提高療效,又縮短萬古霉素使用時間和劑量,從而將萬古霉素的不良反應控制到最低。

1 材料與方法

1.1 菌株 MRSA菌株ATCC43300由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 MH培養基、藥物 MH瓊脂(OXOID)、MH肉湯(北京索萊寶生物科技有限公司)、萬古霉素(中國食品藥品檢定研究院)、痰熱清注射液 10ml(上海凱寶藥業股份有限公司)。

1.3 測定MIC方法 用倍比稀釋法配制瓊脂平板,將MRSA ATCC43300在MH瓊脂上復蘇,然后用接種環挑取2～3個菌落接種于MH肉湯中,37℃培養6 h,制備濃度相當于0.5麥氏標準比濁管的菌懸液(約1.5×106cfu/ml),用多點接種儀接種于含2倍稀釋的萬古霉素單藥及兩藥MH瓊脂平板上每點含菌104 cfu,37℃培養18 h后觀察記錄MIC結果。

1.4 MIC結果判斷 結果根據美國臨床實驗室標準化機構(CLSI)2015年標準,以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低藥物濃度為MIC。

1.5 測定MPC方法 將MRSA菌株在MH培養基上過夜培養,挑取過夜培養的菌落接種于200ml MH肉湯中,37℃震蕩(200次/min)培養6 h后,離心后棄上清液,再次重復以上操作,然后挑取菌落置于MH肉湯中,將菌液濃度調整為3.0×106cfu/ml。用移液槍取100 μl菌液,用L型玻璃棒將菌液均勻涂抹在倍比稀釋抗菌藥物的平板上,37℃溫箱培養72 h后,沒有菌落生長的最低藥物濃度為初測MPC(MPCPr)。用上述方法測定MPCPr后,依次遞減(20%)抗菌藥物濃度,配制含藥濃度范圍為MPC到1/2范圍的瓊脂平板,重復MPCPr測定時的方法,測定72 h無菌落生長的最低藥物濃度定為MPC。

1.6 配制含藥瓊脂平板 ①用二倍稀釋法分別配置含有痰熱清及萬古霉素的瓊脂平板：將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌藥物分別加入已加熱溶解,并在45～50℃水浴中平衡的MH瓊脂中,充分混勻傾倒滅菌平皿,瓊脂厚度3～4mm。所配含萬古霉素瓊脂平板濃度為0～64.0 μg/ml、痰熱清濃度為0～1000.0 μl/ml,制備每個濃度各4個平板。②含聯合用藥瓊脂平板的配制：以萬古霉素和痰熱清單藥的MIC值、MPC值為基準,將定量的萬古霉素加入100mm平皿中,然后再將倍比稀釋的痰熱清溶液加入,余步驟按照配制單藥瓊脂平板的方法操作,制備每個濃度各4個平板。

1.7 根據實驗室所測得的萬古霉素、痰熱清及聯合用藥對MRSA的MIC、MPC計算SI。比較單用及聯合用藥的關系并分析。

2 結果

2.1 萬古霉素對MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分別為0.5 μg/ml 、1 μg/ml、2。

2.2 痰熱清對MRSA ATCC43300的MIC、MPC和SI分別為125 μl/m 、500 μl/ml、4。

2.3 與痰熱清聯用可使萬古霉素對MRSA ATCC43300的MPC和SI較前減小,聯合應用痰熱清濃度達到125.0 μl/ml,萬古霉素的MPC可減少到0.5 μg/ml,SI完全關閉。見表1。

表1 聯用不同濃度的痰熱清后萬古霉素對MRSA的MPC和SI

2.4 與萬古霉素聯用可使痰熱清對MRSA ATCC43300的MPC、SI明顯減小,當聯用濃度達到0.5 μg/ml,痰熱清的MPC即可減少到125 μl/ml,SI完全關閉。見表2。

表2 聯用不同濃度的萬古霉素后痰熱清對MRSA的MPC和SI

3 討論

MRSA在目前醫院感染中占有比例約為30%。國外報道出現萬古霉素中介及耐藥菌株,國內尚無萬古霉素耐藥菌株報道。MRSA感染治療代價高。有學者認為導致萬古霉素失敗的原因很可能是MIC的漂移［1］現象。從 SI 理論分析: MRSA耐藥率之所以上升,可能是由于體內藥物濃度處于細菌的SI之間(MIC和MPC間的藥物濃度范圍),耐藥突變株容易被選擇性富集擴增而產生耐藥。SI(MPC/MIC)為臨床提供了一個新的療效衡量標準,用于比較藥物選擇耐藥菌株的能力；當聯合應用兩種抗菌藥物時,并同時處于各自的 MIC值以上時,細菌需要同時發生兩種耐藥突變后才能被選擇性富集,從而關閉或縮小 SI。通過聯合用藥雖然可以縮窄或者關閉SI,但是另一抗菌藥物的使用很有可能引起其他的耐藥突變,就限制了為縮小藥物的SI采取兩種抗菌藥物的聯合應用。在這種情況下人們將注意力轉向天然藥物。近年來關于中藥抗細菌耐藥性的研究備受關注,通過查閱資料發現痰熱清在臨床上具有明顯的抗感染效果,藥理研究結果表明,該藥不僅有清熱、解毒、消炎、殺菌的作用,而且可以增強白細胞的吞噬,提高機體免疫調節作用［2］。張世有等［3］研究結果表明痰熱清注射液結合西醫基礎治療社區獲得性肺炎較單純西醫治療療效好。宋志香等［4］研究結果表明：痰熱清注射液與萬古霉素注射液具有協同抗菌作用,對治療MRSA感染肺炎具有良好療效。

通過初步探討了痰熱清與萬古霉素聯合對MRSA的MPC的影響,證實此種聯合用藥能降低萬古霉素的MPC,縮小SI,有效的防止耐藥菌的富集。這為臨床應用萬古霉素治療MRSA感染,減少耐藥菌株的出現提供了理論依據。但是考慮到體內環境復雜,與體外研究存在一定的差異,因此尚需進行動物和臨床實驗進一步驗證聯合用藥時藥物代謝動力學與耐藥突變體選擇的關系。

［1］Juan-Ignacio A,Ana GC,Paloma GH,et al.Vancomycin MICs did not creep in Staphylococcus aureus isolates from 2002 to 2006 in a setting with low vancomycin usage.Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2008,62(4):773-775.

［2］王琴,潘靜.痰熱清注射液的藥理作用和臨床應用.華北國防醫藥,2010,22(1):41-43.

［3］張世有,李冬生.痰熱清治療社區獲得性肺炎60例臨床觀察.黑龍江中醫藥,2011,40(3):19-20.

［4］宋志香,李劉坤,李興廣.中藥痰熱清注射液治療MRSA感染性肺炎的臨床觀察研究.中華醫院感染學雜志,2010,20(11): 1596-1598.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.115

2016-02-02］

450000 河南中醫藥大學(陳洋 荊珊珊)；河南省人民醫院呼吸與危重醫學科(陳洋 張文平 佑航標 荊珊珊馬利軍)；新鄉醫學院(佑航標)