神經膠質瘤干細胞樣細胞的分離鑒定及其生物學特性初探

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

·實驗研究·

神經膠質瘤干細胞樣細胞的分離鑒定及其生物學特性初探

李志營 夏云 王占偉 楊偉科 焦繼超

目的探討神經膠質瘤干細胞樣細胞的分離鑒定及其生物學特性。方法采取流式細胞儀分選神經膠質瘤C6細胞中的側群細胞作為觀察組,非側群細胞作為對照組,經3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2(MTT)法對細胞生長曲線進行繪制,對細胞克隆形成能力、球囊形成能力、細胞成瘤能力以及細胞CD133的表達進行檢測分析。結果神經膠質瘤C6細胞中側群細胞所占比例為(4.32±1.41)%；側群細胞生長速度較非側群細胞快(P＜0.05)；在無血清條件下培養,側群細胞具有形成球囊的特性,非側群細胞無此特性；側群細胞克隆形成率高于非側群細胞(P＜0.05)；側群細胞CD133表達水平高于非側群細胞(P＜0.05)。結論在神經膠質瘤中存在有典型的側群細胞,且側群細胞中干細胞標志蛋白CD133呈現為高表達,可以在側群細胞中分選富集神經膠質瘤干細胞樣細胞,值得關注。

神經膠質瘤；干細胞樣細胞；側群細胞；干細胞標志蛋白

本次研究中,出于對神經膠質瘤干細胞樣細胞的分離鑒定及其生物學特性進行分析探討,采取流式細胞儀分選神經膠質瘤C6細胞中的側群細胞和非側群細胞進行了觀察分析,結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 所需試劑包括有鏈霉素、青霉素、Hoechst 33342、MTT、 胎牛血清、干細胞培養基、PRMI 1640培養基、FITC-CD133 抗體。

1.2 細胞系 取神經膠質瘤C6細胞,在37℃、 濃度為15%的二氧化碳條件下,在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml鏈霉素、PRMI 1640培養基中進行培養。

腫瘤的球囊培養采取干細胞無血清培養基,按照說明書進行操作,每3天加1次表皮細胞生長因子(EGF),劑量為20 ng/ml,堿性成纖維生長因子(b FGF)劑量為20 ng/ml,1×B27。

1.3 實驗動物 選擇BALB/c-nu裸鼠20只,鼠齡為5～6周,體重20～25 g,在沒有特殊病原體的條件下進行飼養,分選側群與非側群細胞,分別取103、104、105、106四組,每組中包括有5只裸鼠,在裸鼠皮下接種,1個月后將裸鼠處死,并對成瘤率進行計算。

1.4 流式細胞儀分選側群細胞 選擇對數生長期的神經膠質瘤C6細胞,將其制備成單細胞懸液,并將細胞濃度調整至106/ml,而后加入Hoechst 33342,最終濃度為5mg/L,另外選取1ml細胞,加入維拉帕米,最終濃度為50mg/L,反應30min后,繼續加入Hoechst 33342 作為對照。在37℃條件下,避光染色9min,染色過程中不斷搖晃,將細胞搖勻,避免發生沉淀。而后經流式細胞儀進行側群細胞分選［1,2］。

而后經MTT 法繪制細胞生長曲線,平板克隆法對細胞克隆形成能力進行檢測,無血清懸浮培養對細胞的球囊形成能力進行觀察,裸鼠移植瘤實驗對細胞的成瘤能力進行檢測,流式細胞儀對細胞CD133的表達水平進行檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示,采用t檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 側群細胞分選 神經膠質瘤C6細胞中側群細胞所占比例為(4.32±1.41)%,而加入維拉帕米進行抑制后,側群細胞所占比例在降至(0.05±0.02)%。

2.2 側群細胞與非側群細胞增殖速度 側群細胞與非側群細胞在2、4 d的生長速度比較,差異無統計學意義(P＞0.05),在6、8、10 d時,側群細胞生長速度增加,較非側群細胞快(P＜0.05)。見圖1。

圖1 側群細胞與非側群細胞增殖速度比較

2.3 側群細胞與非側群細胞球囊性生長以及克隆形成能力比較 在無血清條件下,側群細胞存在明顯的球囊形成特性,非側群細胞無此特性。常規條件下培養,側群細胞克隆形成率為(32.08±6.1)%,非側群細胞的克隆形成率為(9.56±3.11)%,比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 側群細胞與非側群細胞CD133表達情況 側群細胞CD133表達水平為(61.87±4.98)%,非側群細胞的CD133表達水平為(1.02±0.76)%,比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

神經膠質瘤具有明顯的浸潤特征,中樞神經系統最為常見的一種惡性腫瘤,手術治療無法徹底根除,即便是結合化療、放療,依舊存在腫瘤復發的可能性。曾有調查顯示［3］,神經膠質瘤在腦腫瘤中所占比例為40.00%～60.00%,為神經系統最為常見的一種的腫瘤,近幾年關于腫瘤治療的技術不斷改進,然而,對膠質瘤治療的預后無明顯改善。目前關于神經膠質瘤的研究不斷深入,并獲得較好的成效。

本次研究中,采取流式細胞儀分選神經膠質瘤C6細胞中的側群細胞和非側群細胞,并對其進行了觀察分析,細胞生長曲線進行繪制,對細胞克隆形成能力、球囊形成能力、細胞成瘤能力以及細胞CD133的表達進行檢測,側群細胞生長速度較非側群細胞快(P＜0.05)；在無血清條件下培養,側群細胞具有形成球囊的特性,非側群細胞無此特性；側群細胞克隆形成率高于非側群細胞(P＜0.05)；側群細胞CD133表達率高于非側群細胞(P＜0.05)。

總之,在神經膠質瘤中存在有典型的側群細胞,且側群細胞中干細胞標志蛋白CD133呈現為高表達,可以在側群細胞中分選富集神經膠質瘤干細胞樣細胞,值得關注。

［1］陳宏頡,王守森,鄭兆聰,等.RNAi 抑制 STAT3 對膠質瘤干細胞的生長抑制作用.中華神經外科雜志,2011,27(9):964-968.

［2］仇波,張東勇,陶鈞,等.一種簡化改良的腦膠質瘤干細胞培養方法.中國神經腫瘤雜志,2011,9(1):7-11.

［3］Chen HJ,Wang SS,Zheng ZC,et al.The inhibition studyof STAT3 siRNA on glioblastoma stem cells.Chinese Journalof Neurosurgery,2011,27(9):964-968.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.09.215

2015-12-29］

450000 河南省鄭州市第七人民醫院神經外科