環介導等溫擴增技術的應用研究進展

王德國， 劉海英,王愛萍

(1.許昌學院 食品與生物工程學院，河南省博士后研發基地，河南 許昌 461000；2.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450000)

環介導等溫擴增技術的應用研究進展

王德國1， 劉海英1,王愛萍2

(1.許昌學院 食品與生物工程學院，河南省博士后研發基地，河南 許昌 461000；2.鄭州大學 生命科學學院，河南 鄭州 450000)

主要論述環介導等溫擴增產生假陽性的兩個可能原因以及圍繞這兩個方面國內外的研究動態,從而為解決環介導等溫擴增技術的應用瓶頸提供理論基礎.

環介導等溫擴增；假陽性；氣溶膠污染；非特異性擴增

日本學者Notomi 等在2000年發明報道了環介導等溫擴增技術[1]，截至目前該報道已被英文論文引用2 199次，該技術通過多對引物實現巧妙的擴增，環介導等溫擴增反應效率非常高.由于無溫度變化的耗時，2002年環引物的提出又進一步縮短了反應時間[2]，所以環介導等溫擴增在反應速度、特異性、靈敏度方面優于鏈式聚合酶反應(PCR)[3-4]、核酸序列依賴性擴增(NASBA)[5-6]、鏈替代擴增反應(SDA)[7]、滾換擴增反應(RCA)[8]和解鏈酶擴增(HAD)[9].然而，環介導等溫擴增技術雖然經過近十五年的研究開發，仍然沒有實際應用，主要是由于這種分子生物學檢測方法假陽性率高.起初絕大多數研究人員認為氣溶膠污染是產生假陽性的主要原因，所以大部分研究都是圍繞氣溶膠污染問題展開的，研究擴增產物檢測方法，以實現不開蓋檢測；現在人們都認為非特異性擴增是引起假陽性的主要原因，所以解決非特異性擴增問題逐漸成為該領域的研究熱點.

1 擴增結果的判讀方法研究

1.1 電泳法

擴增后用2%瓊脂糖電泳分析擴增產物[10-11]，但電泳法需要用高致癌性的熒光染料,如溴化乙錠等，既危害操作人員的健康，又會產生所謂的氣溶膠污染[12].

1.2 濁度法

通過擴增產生的副產物焦磷酸根與鎂離子形成的沉淀物，用肉眼觀察擴增體系的渾濁度來判斷擴增結果[13]，由于擴增反應產生的渾濁度不明顯，所以濁度法檢測容易受檢測人員主觀因素的影響.

1.3 熒光染料法

擴增反應結束后，向反應體系中加入SYBR Green I、PicoGreen等類似的熒光染料[14-15]，通過熒光強度的變化，判斷擴增結果.熒光染料法主要是基于擴增產物DNA進行檢測，染料分子插入到DNA雙螺旋中熒光強度增大，進而判斷擴增結果，而LAMP反應需要多對引物，引物二聚體的產生是難以避免的，也就無法排除二聚體引起的假陽性問題[16-17]，并且擴增后開蓋加入熒光染料還易引起氣溶膠污染.

1.4 金屬離子指示劑

為了避免上述熒光染料對擴增結果的誤判，日本榮研化學株式會社采用鈣黃綠素檢測副產物焦磷酸根來判斷擴增結果[18]，在一些報道中還采用金屬離子指示劑羥基萘酚藍來判斷擴增結果[19-20]，這些金屬離子指示劑可以提前加入到反應體系中，就實現了不開蓋檢測.

1.5 免疫側向層析試紙

通常采用生物素和異硫氰酸熒光素分別標記環介導等溫擴增的引物，擴增后采用印有生物素親和蛋白(avidin)及異硫氰酸熒光素抗體的試紙條檢測[21].免疫側向層析試紙需要擴增反應后開蓋上樣層析，由于擴增后產物量為109，開蓋后容易引起氣溶膠污染，從而降低實用性.

有一種商業化銷售的產品融合了恒溫擴增、核酸雜交、核酸試紙條三種技術，既克服了氣溶膠污染，又避免了引物二聚體引起的假陽性問題.

1.6 實時濁度儀法

通過實時濁度儀如LA-320c監控反應過程，判斷擴增結果[22].但目前實時濁度儀的市場價格40萬左右，遠高于PCR儀的價格，就限制了該技術的推廣應用.

目前該領域的科研工作者普遍認為環介導等溫擴增技術靈敏度高，容易產生氣溶膠污染，交叉污染是導致假陽性率高的主要原因，所以在實現不開蓋檢測方面做了大量研究與嘗試，擴增產物的檢測手段近乎完美，尤其是最近提出的巨磁阻檢測方法[23]，但環介導等溫擴增還不能實際應用.

2 非特異性擴增研究

環介導等溫擴增通過多對引物實現巧妙擴增，使用多對引物難免會形成引物二聚體和出現非特異性擴增，特別是在環介導等溫擴增反應中引物、鎂離子、dNTP和酶的濃度比Real-time PCR中的高出好幾倍.在Real-time PCR研究中，為了避免非特性擴增,需要嚴格控制并優化這四個因素的濃度，越來越多的研究人員認為,導致環介導等溫擴增假陽性率高的主要原因是引物二聚體引起的非特異性擴增.

早在2009年，Sulong Li等研究應用環介導等溫擴增檢測食源性致病菌志賀氏菌，設計了兩套引物，其中一套存在非特異性擴增，首次提出了環介導等溫擴增中非特異性擴增的現象，強調了引物設計的重要性，并對引物篩選提出了一些實用性建議[24].Sulong Li等提出了LAMP檢測方法的相對特異性觀點，揭示了非特異性擴增是引起假陽性的主要原因，而非實驗污染，相關研究成果獲2009年中國國家質檢總局科技興檢三等獎[25].

為了降低非特異性擴增反應，Gandelman等嘗試采用莖引物(Stem Primers)替代環引物(Loop Primers)改進環介導等溫擴增技術，指出環引物比莖引物更容易引起引物二聚體間的相互反應和非特異性擴增[26].孟兆祥等提出了一種DNA擴增的新方法，利用熱穩定的Bst DNA聚合酶驅動跨越式滾環等溫擴增反應，嘗試從另外一個角度解釋環介導等溫擴增技術中的假陽性反應[27].

3 展望

環介導等溫擴增技術主要的應用瓶頸是假陽性率高，可能的原因包括氣溶膠污染和非特異性擴增，目前氣溶膠污染引起的假陽性問題已經解決，因此如何解決非特異性擴增產生的假陽性問題就成為研究熱點.該問題一旦解決，環介導等溫擴增技術必將成為檢測領域一個強有力的分子生物學診斷手段.

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責任編輯：衛世乾

Progress in Research and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification

WANG De-guo1， LIU Hai-ying1, WANG Ai-ping2

(1.HenanPostdoctoralResearchBase,FoodandBioengineeringCollege,XuchangUniversity,Xuchang461000,China；2.LifeScienceCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

We discussed two potential reasons for the false positive in loop-mediated isothermal amplification and research trend at home and abroad on these two aspects,providing theoretical basis for the solutions to the bottleneck problem in loop-mediated isothermal amplification.

loop-mediated isothermal amplification; false positive; aerosol pollution; non-specific amplification

2015-02-23

國家人力資源和社會保障部留守人員科技活動項目；河南省高等學校科技創新團隊支持計劃(15IRTSTHN016)；河南省人社廳博士后研發基地項目；許昌市科技發展計劃項目(1504005)

王德國(1975—)，男，山東菏澤人，副教授，博士，研究方向：食源性致病微生物分子生物學快速檢測方法.

1671-9824(2016)02-0069-04

Q81

A