飛機草總黃酮提取工藝及其急性毒性研究

王小寧， 陳進軍， 葉紹棠， 鄭錦慶， 鞏棟梁， 俞云鵬， 林紅英

(廣東海洋大學動物醫學系，廣東湛江 524088)

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飛機草總黃酮提取工藝及其急性毒性研究

王小寧， 陳進軍， 葉紹棠， 鄭錦慶， 鞏棟梁， 俞云鵬， 林紅英*

(廣東海洋大學動物醫學系，廣東湛江 524088)

摘要[目的]優化飛機草總黃酮提取工藝，并研究飛機草總黃酮提取物對小鼠的急性毒性。[方法]以飛機草總黃酮提取率為關鍵指標，采用超聲波輔助乙醇溶劑提取法，通過單因素試驗和正交試驗設計，對提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度等提取條件進行優化，篩選飛機草總黃酮提取的最佳工藝；以昆明種小鼠為試驗動物，進行飛機草總黃酮提取物口服急性毒性試驗，測定半數致死LD50和最大耐受量。[結果]飛機草總黃酮的最佳提取工藝為提取時間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60(g∶mL)、乙醇濃度70%，飛機草總黃酮提取率為7.13%；飛機草總黃酮提取物對昆明種小鼠的口服LD50未測得，其小鼠口服最大耐受量為80 000 mg/kg。[結論]飛機草總黃酮屬于實際無毒物質。

關鍵詞飛機草；總黃酮；提取工藝；急性毒性；小鼠

飛機草(EupatoriumodoratumLinn)別名香澤蘭，是菊科澤蘭屬多年生草本或亞灌木植物，原產于中、南美洲，1934年在云南首次發現[1]，已快速蔓延至廣東、海南等華南廣大地區，是我國外來入侵種中危害最為嚴重的植物之一。迄今從飛機草中分離、鑒定出的化學成分主要有黃酮類、萜類、揮發油和植物甾醇類，未檢出糖類和生物堿類，其中黃酮類化合物含量特別豐富[2-5]。黃酮類化合物是一類多酚類物質，廣泛存在于高等植物及以植物為原料的食品中，具有清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒等生物活性，是一類極具開發前景的天然藥物[6-8]。

飛機草入侵性極強，可入侵草地、農田、林地等，并很快成為優勢種群。飛機草能產生化感物質，抑制鄰近植物的生長，對畜牧業、農業、林業和生物多樣性產生了嚴重的危害，還會造成二次環境污染(如化學除草劑)和生態破壞(如挖除)[9]。飛機草提取物對害蟲具有良好的產卵驅避作用和殺蟲、抑菌作用，其葉的浸提液抑制作用最大[10]。飛機草還具有散瘀、消腫、解毒和止血功效，主要用于跌打腫痛、瘡瘍腫毒、皮炎和外傷出血等，是我國民間常用草藥之一[10-11]。此外，飛機草的提取物可抑制綠膿桿菌、大腸桿菌、淋球菌、金黃色葡萄球菌等的生長，并對傷口的愈合具有一定的治療效果[11]。因此，對飛機草進行藥學和毒性研究是將其“變害為寶”的有益嘗試。筆者采用正交試驗設計對飛機草總黃酮提取條件進行篩選，優化飛機草總黃酮提取工藝，探索提取飛機草總黃酮的最佳條件，并對飛機草總黃酮提取物進行小鼠口服急性毒性試驗，進而為飛機草總黃酮提取物在臨床用藥劑量及其不良反應監測提供試驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。飛機草，于夏季采自廣東省湛江市湖光巖東，經廣東海洋大學農學院植物學教研室鑒定為飛機草(EupatoriumodoratumLinn)。普通級昆明種小鼠，80只，雌雄各半，體重為 18~22 g，購自廣東醫學院實驗動物中心。飛機草總黃酮提取物，按照試驗設計得出的最優提取工藝流程得到飛機草乙醇提取物溶液，根據小鼠急性毒性試驗要求，配置成相應濃度溶液分裝于試管中，進行密封保存于4 ℃冰箱中冷藏，用于小鼠急性毒性試驗。

1.1.2儀器。YS-701型超微粉碎機，北京燕山正德機械設備有限公司；電子分析天平(AY120)，日本島津電子科技有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司(頻率40 kHz)；旋轉蒸發器(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠；循環水多用真空泵(SHZ-Ⅱ)，河南鞏義市英峪予華儀器廠；分光光度計(V-1000型)，翱藝儀器(上海)有限公司。

1.1.3試劑。蘆丁標準品(MUST-14082710，世紀奧科廣州分公司)；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁，均為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1單因素試驗。

1.2.1.1提取時間對飛機草總黃酮提取率的影響。準確稱取2.0 g干燥恒重的飛機草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預先輔助提取(超聲波輔助條件為時間30 min、溫度30 ℃、功率300 W)[12-13]，然后在60%乙醇、料液比1∶40、溫度70 ℃條件下提取2、3、4、5、6、7 h，測定飛機草總黃酮的提取率。

1.2.1.2提取溫度對飛機草總黃酮提取率的影響。準確稱取2.0 g干燥恒重的飛機草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預先輔助提取，在60%乙醇、料液比1∶40、不同溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)的條件下提取4 h，測定飛機草總黃酮的提取率。

1.2.1.3料液比對飛機草總黃酮提取率的影響。準確稱取2.0 g干燥恒重的飛機草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預先輔助提取，在60%乙醇、溫度70 ℃、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的條件下提取4 h，測定飛機草總黃酮的提取率。

1.2.1.4乙醇濃度對飛機草總黃酮提取率的影響。準確稱取2.0 g干燥恒重的飛機草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預先輔助提取，在不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比1∶40、溫度70 ℃的條件下提取4 h，測定飛機草總黃酮的提取率。

1.2.2正交試驗。在單因素試驗的基礎上確定正交試驗工藝參數范圍，進行正交試驗，設計提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度4個因素，以飛機草總黃酮提取率為指標，進行 L9(34)正交試驗，因素水平如表1所示。若該正交試驗未出現最佳提取條件組合，則進行相關驗證性試驗，綜合判定和選擇優化提取條[14]。

表1飛機草總黃酮提取工藝正交因素水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test of the extraction technology of total flavonoids fromEupatoriumodoratumLinn

水平Level因素FactorA(提取時間Extractiontime)∥hB(提取溫度Extractiontemperature)∥℃C(料液比Solid-liquidratio)D(乙醇濃度Ethanolconcentration)%15601∶405026701∶506037801∶6070

1.2.3蘆丁標準曲線的制作。準確量取烘箱干燥、恒重的蘆丁標準品 20 mg，用 20%乙醇超聲波溶解，并定容至250 mL，配成 0.08 mg/mL的標準溶液。精確吸取標準品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別于 25 mL容量瓶中，加入0.05 g/mL亞硝酸鈉1.0 mL，混合均勻，靜置 5 min，加入0.10 g/mL的硝酸鋁 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加入0.04 g/mL的氫氧化鈉 10 mL，加入體積分數為20%的乙醇定容至 25 mL，搖勻，放置 10 min，于 510 nm波長處測定吸光度[15]，以空白試劑為參比液。橫坐標為蘆丁濃度、縱坐標為吸光度繪制標準曲線，用 Excel線性回歸得標準曲線方程為y=11.587x-0.002 8(R2=0.998 9)，可見蘆丁檢測濃度范圍在 0.001 4~0.019 6 mg/mL吸光度與蘆丁的含量呈線性關系(圖1)。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　Standard curve of rutin

1.2.4飛機草總黃酮提取率的測定。飛機草總黃酮提取率測定方法采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[16-17]。將2 g粉末狀飛機草提取物加入蒸餾水定容至 250 mL，準確吸取 1 mL于 25 mL的容量瓶中，加入0.05 g/mL亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻，放置 5 min，加入0.10 g/mL的硝酸鋁1.0 mL，搖勻，放置6 min，加入0.04 g/mL的氫氧化鈉 10 mL，搖勻，放置10 min，于 510 nm波長處測定吸光度。同時以空白試劑作為參比液，由制作的標準曲線算出總黃酮提取率。飛機草總黃酮提取率= (A+0.002 8)×25×250×100/(11.587×1 000×2),式中,A為吸光度值。

1.2.5飛機草總黃酮提取物LD50測定。

1.2.5.1預試驗。取小鼠 9只，雌雄兼有，隨機等分為 3組，分別按 0、5 000、10 000 mg/kg灌服飛機草總黃酮提取物。給藥后 3~4 h復食，停藥 7 d期間觀察并記錄中毒狀況、死亡時間及數量[18]。

1.2.5.2正式試驗。取小鼠50只，隨機等分為空白對照組和 4個試驗組，每組 10只，雌雄各半。小鼠禁食 8 h后進行經口給藥，分別對試驗組Ⅰ、試驗組Ⅱ、試驗組Ⅲ和試驗組Ⅳ小鼠按 10 240、12 800、16 000、20 000 mg/kg(組間劑量比為1∶0.8[19])灌服飛機草總黃酮提取物，對照組小鼠灌服等量飲用水。給藥后 3~4 h復食，停藥 7 d期間觀察小鼠精神、食欲、飲水、糞便、活動等情況，記錄中毒狀況、死亡時間及數量。試驗結束后，剖檢各組小鼠[18]。

1.2.5.3最大耐受量的測定。取小鼠 20只，隨機等分為 1個空白對照組及 1個試驗組，每組 10只，雌雄各半。小鼠禁食 8 h后進行經口給藥，試驗組以 1 d內按最大給藥濃度(20 000 mg/kg)、最大給藥劑量(40 mL/kg)灌胃一次。對照組給予同量飲用水。給藥后 3~4 h復食，停藥 7 d期間觀察小鼠精神、食欲、飲水、糞便、活動等情況，記錄中毒狀況、死亡時間及數量。試驗結束后，剖檢各組小鼠。

1.3數據分析采用Excel、SPSS19.0 進行數據分析和表圖制作。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1提取時間對飛機草總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在一定范圍內，隨著時間的增加，飛機草總黃酮提取率逐漸增大，在6 h達最大值，為 7.08%，繼續增加時間，總黃酮提取率反而降低。因此 6 h為提取的最優時間。

圖2　提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2提取溫度對飛機草總黃酮提取率的影響。由圖3可知，在一定范圍內，隨著提取溫度的升高，飛機草總黃酮提取率逐漸增加，當溫度達 70 ℃時，飛機草的總黃酮提取率達最大值，為 6.81%。

圖3　提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3料液比對飛機草總黃酮提取率的影響。由圖4可知，在一定范圍內，隨著料液比的增加，飛機草總黃酮提取率先增加后減少，當料液比為1∶50時飛機草總黃酮提取率達最大值(7.05%)。

圖4　料液比對總黃酮提取率的影響Fig.4　 Effects of solid-liquid rate on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4乙醇濃度對飛機草總黃酮提取率的影響。由圖5可知，在一定范圍內，飛機草總黃酮提取率隨著乙醇濃度升高而升高。提高乙醇濃度達 60%時，飛機草總黃酮提取率為最大值(6.62%)，繼續提高濃度，總黃酮提取率反而下降。因此乙醇濃度60%為最佳提取濃度。

圖5　乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.5　Effects of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2正交試驗結果從表2可知，每個因素對飛機草總黃酮提取率均有一定的影響，各因素對總黃酮提取率影響的相關性排列順序為C>D>A>B，即料液比>乙醇濃度>提取時間>提取溫度，各因素最佳提取條件組合為A1B2C3D3，即提取時間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60、乙醇濃度70%。由于正交試驗中不包含A1B2C3D3組合，因而又進行了相關驗證性試驗[14]，進行了3次平行試驗，通過驗證試驗，在A1B2C3D3組合下的飛機草總黃酮得率為7.13%，高于正交試驗中最高值。說明利用正交試驗優化飛機草總黃酮提取工藝成功。

表2　正交試驗結果

2.3飛機草總黃酮提取物急性毒性試驗結果 在預試驗中小鼠無死亡，且剖檢無明顯病理變化，可知飛機草乙醇提取物LD50>10 000 mg/kg[18]。在半數致死量測定的正式試驗中，小鼠無死亡，剖檢無明顯病理變化，未測出LD50，說明LD50> 20 000 mg/kg[20]。

3結論與討論

飛機草黃酮類化合物含量豐富，具有較高的利用價值。該研究采用超聲波輔助乙醇浸提法提取飛機草總黃酮，設計單因素試驗和L9(34)正交試驗，得到最佳提取條件組合為A1B2C3D3，即提取時間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60、乙醇濃度70%，且提取的飛機草總黃酮得率為7.13%。優化后的提取工藝與王韻等[4,20-22]研究的結果相比，降低了提取溫度，節約能源，降低了提取工藝成本，適合提取飛機草總黃酮。

飛機草總黃酮對小鼠經口急性毒性試驗結果表明在預試驗中小鼠無死亡，且剖檢無明顯病理變化，根據化合物經口急性毒性分級標準[23]，一次經口LD50>15 000 mg/kg，說明是無毒物質。在該研究中，因未測出LD50，故在1 d內以最大給藥濃度(20 000 mg/kg)、小鼠最大口服容量(40 mL/kg)灌服藥物1次，供試小鼠在7 d觀察期中均無出現死亡，精神、飲水、采食和活動等均良好，偶見稀便，且剖檢無明顯病理變化。根據最大給藥濃度和最大給藥體積[24-25]，計算得小鼠口服飛機草總黃酮提取物的最大耐受量為80 000 mg/kg，表明飛機草總黃酮屬于實際無毒物質。

參考文獻

[1] 單家林.海南島外來植物群落初探[J].熱帶農業科學,2003,23(3):1-4.

[2] MOHAMMAD A H.Chemical constituents ofEupatoriumodoratumLinn (Compositae)[J].Bangladesh Chem Soc,1995,8:139.

[3] 張嫚麗.東北紅豆杉、飛機草的化學成分研究及土木香中活性成分的微生物轉化研究[D].石家莊:河北醫科大學,2010：9-11.

[4] 王韻，司馬碩丹,李繼霞,等.飛機草化學成分研究[J].中草藥,2012,43 (12)：2351-2355.

[5] 袁經權,楊峻山,繆劍華.飛機草黃酮類成分的研究[J].中藥材,2007,30(6):657-660.

[6] 謝棒祥,張敏紅.生物類黃酮生理功能及其應用研究進展[J].動物營養學報,2003,15(2):11-15.

[7] CHOI E M. Protective effect of quercetin against hydrogen peroxide-induced dysfunction in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].Exp Toxicol Pathol,2012,64:211-216.

[8] CUSHNIE T P，LANMB A L.Antimicrobial activity of flavonoids[J].Int J Antimicrob Agents,2005,26(5):343-356.

[9] 陳進軍,黎秋旋,肖俊梅.飛機草在廣東的分布、危害及化學成分預試[J].生態環境學報,2005,14(5):686-689.

[10] 郇樹乾.飛機草對熱研二號柱花草化感作用初步研究[J].廣東農業科學,2014,41(1):86-89.

[11] PHAN T T,HUGHES M A,CHERRY G W.Effects of an aqueous extract from the leaves ofChromolaenaodorataon the proliferation of human keratinocytes and on the immigration in aninvitromodel of reepithelialization[J].Wound Repair Regen,2001,9(4):305-313.

[12] 徐麗萍,喻方圓,陳浩,等.超聲波提取杜仲皮總黃酮工藝[J].林業科技開發,2010,24(4):82-84.

[13] 郭雪峰,岳永德.黃酮類化合物的提取·分離純化和含量測定方法的研究進展[J].安徽農業科學,2007,35(26):8083-8086.

[14] 陳海琴,張麗敏.正交試驗法優化紫荊果總黃酮提取工藝的研究[J].黑龍江畜牧獸醫,2014(8):171-173.

[15] 王桂榮,張燕娣,張連學.響應面法優化飛機草總黃酮提取工藝[J].北方園藝,2012(15):78-82.

[16]馬雯芳,鄧慧蓮,蔡毅,等.冰糖草總黃酮含量測定及顯色方法優化[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(3):112-115.

[17] 任珊珊,包保全,毛婷,等.中藥中總黃酮的含量測定方法研究進展[J].北方藥學,2015,12(3):112-115.

[18] ROBINSON S，DELONGEAS J L，DONALD E,et al.A European pharmaceutical company initiative challenging the regulatory requirement for acute toxicity studies in pharmaceutical drug development[J].Regul toxicol pharmacol,2008,50(3):345-352.

[19] 袁媛,邱霞.急性毒性試驗研究進展[J].海軍醫學雜志,2013,34(5):360-361.

[20] ICH.Guide line M3(R2):Nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing andhorization for Pharmaceuticals [EB/OL].(2008-07-01)[2015-12-01].http://www.icb.org.

[21] OWOYELE V B,ADEDIJI J O,SOLADOYE A O.Anti-infiammatory activity of aqueous leaf extract ofChromolaenaodorata[J].Inflammopharmacol,2005,13(5/6):479-484.

[22] 楊逢建,楊磊,張衷華,等.高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定飛機草總黃酮的質量分數[J].東北林業大學學報,2008,36(10):43-45.

[23] 史志誠.動物毒物學[M].北京:中國農業出版社,2001：892.

[24] 張林媛,孫金秀.上下增減劑量法與Horn’s法測定LD50的研究[J].衛生毒理學雜志,2003,17(4):234-236.

Extraction Trocess Optimization and Acute Toxicity of Total Flavones fromEupatoriumodoratumLinn

WANG Xiao-ning,CHEN Jin-jun,YE Shao-tang,LIN Hong-ying*et al (Dept.of Veterinary Medicine,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,Guangdong 524088)

Abstract[Objective]To optimize the extraction process of total flavones fromEupatoriumodoratumLinn and study the acute toxicity of the total flavones extract to mice.[Method] The extraction yield of the total flavones was taken as the key index,using the ultrasonic assisted ethanol solvent extraction method,the extraction time,extraction temperature,liquid to solid ratio and ethanol concentration were optimized through single factor test and orthogonal test design,the optimum process of the total flavones extract fromEupatoriumodoratumLinn was selected.And a range of KM mice were orally administered with the total flavones extract fromEupatoriumodoratumLinn to determine the median lethal dose (LD50) and maximum tolerated dose.[Result]The optimized extraction process for the total flavones fromwere the extraction time of 5 h,extraction temperature of 70 ℃,liquid to solid ratio of 1∶60 and solvent of 70% ethanol,and the total flavones extraction rate was 7.13%.The oral acute toxicity of the total flavones extracted fromEupatoriumodoratumLinn to KM mice was not determined and the maximum tolerated dose was 80 000 mg/ml.[Conclusion]The total flavones fromEupatoriumodoratumLinn was the actual non-toxic substances.

Key wordsEupatoriumodoratumLinn;Total flavones;Extraction process;Acute toxicity;Mice

收稿日期2015-12-24

作者簡介王小寧(1988-)，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：動物營養與飼料科學。*通訊作者，副教授，從事動物醫學與毒理學研究。

基金項目湛江市財政資金科技專項競爭性分配項目(A14031)。

中圖分類號S 567.23+9

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)02-162-04