小鼠非手術胚胎移植方法

小鼠非手術胚胎移植方法

小鼠作為發(fā)育和生殖生物學研究中最常見的模式動物，其研究的主要環(huán)節(jié)離不開胚胎移植技術。小鼠非手術胚胎移植法是將供體小鼠的胚胎經子宮頸移植到受體小鼠子宮內的一種移植方法。它與手術法相比，簡單快捷，對小鼠的損傷小，大大簡化了胚胎移植的操作過程。早在1951年，R. A.Beatty首先對動物非手術胚胎移植法進行了報道，隨后 L.Marsk、T. Davis、F.A.Van der Hoeven等也相繼對非手術胚胎移植法進行了研究，但直到1964年才正式應用非手術胚胎移殖技術，但主要還是以牛的胚胎移植為主，本文主要介紹了小鼠非手術胚胎移植的整個過程，讓我們對非手術胚胎移植方法有一個基本的認識。

1 試驗準備

1.1 供試小鼠。試驗所用小鼠為6～8周齡的CD-1品系小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。試驗動物房保持溫度為22℃～25℃，濕度為50%～60%，采用12L∶12D的循環(huán)光照制度。試驗小鼠飼喂商業(yè)購買的小鼠普通繁殖飼料，均為自由采食飲水，試驗動物房由專人清潔打掃，保證環(huán)境的清潔衛(wèi)生。試驗的所有操作均獲河北農業(yè)大學實驗室動物保護與使用委員會許可，符合動物試驗的3R原則。

1.2 胚胎與受體準備。將自然發(fā)情的母鼠按1∶1的比例與正常公鼠合籠，第二天清晨觀察母鼠陰道栓來確定是否交配，見栓即作為供體小鼠，記為見栓0.5 d。見栓3.5 d時，用頸部脫臼法處死小鼠，剪下小鼠的子宮放到盛有M2操作液的培養(yǎng)皿中，由宮管結合部靠近子宮角側剪斷子宮，用注射器吸取M2操作液從子宮頸端沖出囊胚。在體視顯微鏡下用口吸管將形態(tài)正常的囊胚依次轉移到幾滴大小均勻的M2操作液滴中洗滌干凈，待后續(xù)試驗。

挑選發(fā)情狀況良好的母鼠與結扎公鼠合籠，如果結扎公鼠的數目有限，可按1∶2合籠(即一只公鼠與兩只母鼠合籠)，合籠的第二天清晨檢查陰道栓，見栓的母鼠記為假孕0.5 d。依次類推至假孕2.5 d，即可進行非手術胚胎移植。假孕的母鼠在移植前注射1.25%的阿佛丁進行麻醉(每克體重0.02 ml)，每只母鼠移植囊胚6～10枚，分娩后記錄活仔數以待分析。

1.3 移植器械的制備

1.3.1 玻璃導管的制備。玻璃管在酒精燈火焰上輕烤使之軟化，離開火焰迅速用鑷子拉伸玻璃管，最終制備的玻璃毛細管外徑約為0.6 mm，內徑約為0.4 mm，將玻璃細管插入10 μl的槍頭中，并在二者接合處套上長度約為5 mm的膠管(內徑為0.79 mm，外徑為2.38 mm)，以保證器械的密封性。從膠管處開始測量玻璃管的長度，長度約為25 mm；若玻璃管過長，則用砂輪截取合適長度，然后將玻璃管尖端與酒精燈火焰短暫接觸，使末端鈍圓，以減少胚胎移植過程中由器械造成的子宮損傷。最后將制備好的玻璃針高壓滅菌(121℃，15 min)，放置于60℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干后備用。

1.3.2 非手術移植器械PTFE管的制備。將10 μl的槍頭與外徑0.6 mm、內徑0.3 mm的聚四氟乙烯(PTFE)管(Model 30 L，深圳沃爾)組裝，露出長度約為25mm，PTFE管與10 μl槍頭的接合處用熱縮管(φ0.6 RSFR-125H，深圳沃爾)固定。從熱縮管端開始測量PTFE管的長度，分別截取1.5 cm、2.0 cm、2.5 cm，然后在酒精燈下將PTFE管與酒精燈火焰短暫接觸，使末端鈍圓。將制備好的非手術移植器械高壓滅菌(121℃，15 min)，并在60℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干后備用。最后將直徑為4 mm的醫(yī)用聚乙烯管截成10 mm的小段，作為小鼠開膣管，然后在酒精燈下將管斷端燒烤圓滑無毛刺，以避免劃傷小鼠陰道。

2 移植過程

2.1 胚胎的吸取。在60 mm的培養(yǎng)皿中做一個40 μl的M2液滴，每滴放入6～10枚囊胚，將移液器量程調至1.5 μl，然后將移液器吸頭與非手術移植器械牢固接合，移液器控制按鈕按到第一個停點，將PTFE管傾斜至M2液滴中，首先吸取長度約為5 mm的M2液柱。然后，在體視顯微鏡下將囊胚全部吸入管中，如果第一次吸入失敗，可將已吸入的囊胚及M2液體打出，并更換移植器械，準備第二次吸入胚胎，因為潮濕的移植管很難再次吸入胚胎。胚胎吸入移植管后，將移液器放到架子上，保證管頭不要碰到任何東西，等待移植。

2.2 移植過程

2.2.1 假孕小鼠腹腔注射1.25%的阿佛丁進行麻醉(每克體重0.02 ml)。

2.2.2 將假孕鼠置于鼠籠籠蓋上，使其前爪緊抓住籠蓋，用拇指和食指抓住小鼠尾根部輕輕提起，其余三指向下按壓小鼠背部，將其固定。

2.2.3 將直徑為4 mm的開膣器插入小鼠陰道底部，在冷光源下觀察暴露的子宮頸口。

2.2.4 將吸有胚胎的移植管插入子宮頸口，沿子宮頸口緩慢推進移植管進入小鼠的一側子宮角，推進過程中旋轉移液器和移植導管，讓移植導管彎曲的方向和小鼠子宮頸延伸的方向保持一致，若無法進入則立即將移植管退出，并在體視顯微鏡下觀察胚胎是否丟失，管口是否堵塞，然后重新移植。當移植導管上的熱縮管到達子宮頸口時，按壓移液器到第一停點，將胚胎移入子宮內。移植后邊旋轉邊緩慢退出移植導管約5 mm，然后將移植導管與移液器分離，注意不要旋轉移植管，緩慢拔出移植導管并觀察導管中是否有液體殘留。

2.2.5 取出開膣管，將假孕小鼠放回籠中。

總之，小鼠非手術胚胎移植相對于手術法更符合動物福利原則，而且術后不易感染，是未來研究的熱門課題。

[1]GreenM，BassS，SpearB.A device for the simple and rapidtranscervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications[J].BioTechniques，2009，47(05)：919～924.

[2]Beatty R.A.Transplantation of mouse eggs[J]. Nature，1951，168(4284)：995.

[3]MarskL，LarssonKS.A simple method for nonsurgical blastocyst transfer in mice[J].Journal of reproduction and fertility，1974，37(02)：393～398.

[4]OrtizME，LladosC，CroxattoHB.Embryos of different ages transferred to the rat oviduct enter the uterus at differenttimes[J].Biology of Reproduction，1989，41(03)：381～384.

071000 河北農業(yè)大學動物科技學院 蔣 瑞 岳巧嫻 王澤偉

河北農業(yè)大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目：小鼠非手術胚胎移植器的研究(20160403)