β-欖香烯對人食管癌細胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3的影響

任凌燕　徐　磊　趙　青　羅　皓　趙　怡

作者單位:210000 解放軍第四五四醫院

?

β-欖香烯對人食管癌細胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3的影響

任凌燕徐磊趙青羅皓趙怡

作者單位:210000 解放軍第四五四醫院

【摘要】目的研究β-欖香烯對人食管癌細胞EC9706增殖、凋亡及caspase-3表達的影響。方法采用不同濃度的β-欖香烯(0、10、20、30、40、50 μg/ml)處理細胞24 h，CCK-8測定細胞增殖活力。以50 μg/ml β-欖香烯處理細胞0、6、12、24 h，CCK-8測定細胞增殖活力。以不加β-欖香烯組作為對照組，選取50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h，流式細胞術測定細胞凋亡率，分光光度法測定 caspase-3活性。結果隨著β-欖香烯濃度的增加，人食管癌細胞增殖活力逐漸下降，呈濃度依賴性(P<0.05)。以50 μg/ml β-欖香烯處理細胞 0、6、12、24 h，隨著時間的增加，細胞增殖活力下降，呈現時間依賴性(P<0.05)。相比對照組，50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h后細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，caspase-3活性明顯增加(P<0.05)。結論β-欖香烯可抑制食管癌細胞增殖、誘導其凋亡，并且其誘導凋亡的作用機制可能與促進caspase-3活化有關。

【關鍵詞】β-欖香烯；人食管癌細胞；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:202～204)

食管癌為我國常見惡性腫瘤之一，在我國全部惡性腫瘤中，其發病率和死亡率分別占第4位和第2位[1]。β-欖香烯是從中藥莪術中提取出來的二類抗癌新藥，具有抗癌活性。也有較多研究[2-3]表明欖香烯對諸多腫瘤有抗癌效應。本實驗采用β-欖香烯對食管癌細胞的干預，觀察其對細胞增殖、凋亡及caspase-3活性的影響。

1材料與方法

1.1　材料

食管癌細胞株(EC9706)購自上海北諾生物科技有限公司，β-欖香烯購自大連金港制藥有限公司；完全培養基采用DMEM培養基、10%胎牛血清、青霉素100 U/L、鏈霉素100 U/L(美國Gibco)；CCK-8試劑盒(東京同仁化學)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基)；caspase-3分光光度法測試劑盒(南京凱基)。

1.2　方法

1.2.1細胞培養將食管癌細胞置于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中培養，培養條件：37 ℃、5% CO2及飽和濕度。貼壁生長至融合狀態，用0.25%胰蛋白酶0.53 mmol/L EDTA 消化，選擇生長狀態良好的細胞進行傳代。將細胞以 104個/ml接種在6孔板，細胞貼壁融合達70～80%時，更換為無血清DMEM培養液同步化24 h。每次實驗均采用同一代細胞，不同批次細胞重復實驗3次。

1.2.2不同濃度β-欖香烯處理細胞24 h后細胞增殖活力測定將細胞隨機分組：分別用含0、10、20、30、40、50 μg/ml的β-欖香烯加入培養基中，處理細胞24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,繼續在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下孵育4 h，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，測定細胞增殖活力。

1.2.350 μg/ml的β-欖香烯處理細胞0、6、12、24 h后細胞增殖活力測定將細胞隨機分組：分別用含50 μg/ml的β-欖香烯加入培養基中，處理細胞0、6、12、24 h，96孔板中每孔加入CCK-8 20 μl,繼續在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下孵育4 h，酶標儀450 nm波長處測定各孔的OD值，測定細胞增殖活力。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡以不含β-欖香烯的培養基處理組作為對照組。選取50 μg/ml的β-欖香烯加入培養基中，處理細胞24 h，0.25%胰酶(無EDTA)消化并收集細胞，PBS洗滌，Annexin Ⅴ/PI 染色后流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.5caspase-3活化程度的檢測細胞分組同1.2.4，干預 24 h，冰上裂解細胞,吸取50 μl含100～200 μg蛋白的細胞裂解液，加入Reaction Buffer、caspase-3 Substrate，避光孵育4 h。酶標儀波長400 nm測定各組吸光值(OD值)，通過各組OD值/健康人血清組OD值的倍數來確定各組caspase-3活化程度。

1.3　統計學分析

2結果

2.1　不同濃度β-欖香烯處理細胞24 h后對細胞增殖

活力的影響

與0 μg/ml組OD值(2.34±0.46)比較，10、20、30、40、50 μg/ml組細胞增殖活力下降(OD值分別2.16±0.37、1.76±0.54、1.57±0.29、1.28±0.35、0.80±0.19)，并呈現濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

a為與0 μg/ml組比較，P<0.01;b為與50 μg/ml組比較，P<0.01。

2.2　50 μg/ml β-欖香烯處理細胞0、6、12、24 h后對細胞增殖活力的影響

和0 h組OD值(2.46±0.18)比較,6、12、24 h組細胞增殖活力下降(OD值分別為1.48±0.46、1.27±0.35、0.74±0.24)，并呈現時間依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

a為與0 μg/ml組比較，P<0.01。

2.3　50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h時對細胞凋亡的影響

與對照組(0 μg/ml β-欖香烯)凋亡率[(1.21±0.59)%]比較，50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h，可誘導細胞凋亡[凋亡率(16.21±0.32)%]，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3　0、50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h，對細胞凋亡的影響

2.4　50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h時對 caspase-3活性的影響

與對照組(0 μg/ml β-欖香烯)相比，50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h可明顯增加caspase-3活性，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4　0、50 μg/ml β-欖香烯處理細胞24 h，對細胞

3討論

欖香烯(1-甲基-1-乙烯基-2,4-異丙烯基-環己烷)提取自姜科植物莪術，這是一種新型的抗癌藥。欖香烯提取物是一種混合物，含有β-、δ-和γ-欖香烯，其中β-欖香烯是主要成分，在3種亞型中占60%～72%。在我國，欖香烯已經在治療白血病以及腦部、乳腺、胸部、肝臟和其他組織的癌癥中顯示出療效[4]。作為一種抗癌藥，β-欖香烯的主要優勢包括：對于許多類型的癌癥具有廣譜抗癌效果，包括耐藥腫瘤，它不會導致多重藥物耐藥性，而且能夠逆轉對其他藥物產生的耐藥性并且毒性低。

已有大量實驗研究證實該藥對多種癌細胞有顯著的抑殺作用，能夠誘導腫瘤細胞凋亡和分化，通過癌細胞S、G2、M 期調控點，阻滯S期細胞進入G2、M 期。該藥不同于傳統的化療藥物之處：其無骨髓毒性，亦可提高機體免疫功能，升高白細胞數量，屬非細胞毒抗腫瘤藥[5]。與化療藥物聯合使用具有增敏減毒、提高患者生活質量以及不良反應輕微等顯著特點[6]。本研究顯示，β-欖香烯可以抑制食管癌細胞的增殖，并且其抑制作用與劑量、作用時間相關，呈現濃度依賴性和時間依賴性。

細胞凋亡異常是多種疾病產生的發病機制，通常見于腫瘤、自身免疫疾病、神經系統疾病和心血管系統疾病等。腫瘤是一種細胞增殖和死亡均發生了異常的疾病，細胞凋亡不僅在腫瘤發生和發展中有重要意義,而且化療、放療和生物治療的原理就是通過誘導細胞凋亡來治療腫瘤的[7]。本研究結果提示：相比正常對照組，β-欖香烯可誘導食管癌細胞凋亡。

caspase蛋白酶家族屬于天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,在機體細胞獲得凋亡信號后,caspase通過結合特異的輔因子而被激活,后經一系列的切割,效應caspase最終被激活,將其它酶蛋白作為級聯切割底物并引發細胞凋亡[8]。caspase-3是參與細胞凋亡的重要機制，可通過與眾多蛋白因子的相互作用調控細胞凋亡[8]，它的活化是凋亡進入不可逆階段標志[9]。caspase-3的表達不但反映了細胞凋亡水平，而且證明了凋亡啟動因素的存在。本研究結果提示，β-欖香烯可促進食管癌細胞caspase-3活化，這也可能是β-欖香烯誘導食管癌細胞凋亡的機制。

總之，本研究表明,β-欖香烯可抑制食管癌細胞增殖、誘導食管癌細胞凋亡，并且其誘導凋亡的機制可能與其促進caspase-3活化有關。

參考文獻

[1]張思維,陳萬青,孔靈芝,等.中國部分市縣1998-2002年惡性腫瘤的發病與死亡〔J〕.中國腫瘤,2006,15(7):430-438.

[2]左云飛，張耀錚，魏巍，等.欖香烯誘導肝癌腹水瘤細胞系HcaF53/CL-16A3 凋亡的實驗研究〔J〕.中藥藥理與臨床,1998,14(2):20-22.

[3]鄒麗娟，劉偉先，于麗敏，等.β-欖香烯誘導K562白血病細胞凋亡〔J〕.中華腫瘤雜志,2001,23(3):196-198.

[4]Guan C,Liu W,Yue Y，et al.Inhibitory effect of β-elemene on human breast cancer cells〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7):3948-3956.

[5]Li LJ，Zhong LF，Jiang LP，et al.β-Elemene radiosensitizes lung cancer A549 cells by enhancing DNA damage and inhibiting DNA repair〔J〕.Phytother Res,2011,25(7):1095-1097.

[6]Xu HB,Li L,Fu J,et al.Reversion of multidrug resistance in a chemoresistant human breast cancer cell line by β-Elemene〔J〕.Pharmacology,2012,89(5-6):303-312.

[7]Nicholson DW,Thornberry NA.Apoptosis:Life and death decisions〔J〕.Science,2003,299(5604):214-215.

[8]Choi YJ,Kang JS,Park JH,et al.Polyphenolic flavonoids differ in their antiapoptotic efficacy in hydrogen peroxide-treated human vascular endothelial cells〔J〕.J Nutr,2003,133(4):985-991.

[9]Zhang Y,Goodyer C，LeBlanc A.Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjected with active caspase-3,-6,-7,and-8〔J〕.J Neurosci,2000,20(22):8384-8389.

(編輯：甘艷)

Effect of β-elemene on Proliferation，Apoptosis and Activity of Caspase-3 of the Human Esophageal Carcinoma Cell EC9706

RENLingyan，XULei,ZHAOQing,etal.No.454HospitalofPLA,Nanjing,210000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of β-elemene on the proliferation and apoptosis of human esophageal carcinoma cell EC9706,and to explore the possible mechanisms of apoptosis induced by β-elemene.MethodsHuman esophageal carcinoma cell EC9706 were incubated in vitro.Cells were treated with different concentrations of β-elemene (0、10、20、30、40、50 μg/ml)for 24 h or treated with 50 μg/ml β-elemene for 0,6,12 and 24 h,and the proliferation of EC9706 cells was evaluated by CCK-8.EC9706 cells were treated with 50 μg/ml β-elemene for 24 h.The apoptosis were tested by flow cytometry and the activity of caspase-3 was measured by spectrophotometry.ResultsThe proliferation of EC9706 cells was inhibited in the β-elemene in a certain range of concerntration(0~50 μg/ml).With the increase of β-elemene concerntration,the proliferation of EC9706 cells was inhibited in a concerntration-dependent manner (P<0.05) .Compared with EC9706 cells treated in 0 hours,the proliferation of EC9706 cells was significantly decreased in 6，12 and 24 hours(P<0.05).The apoptosis rate was greater when EC9706 cells were incubated in 50 μg/ml β-elemene for 24 h than that in 0 μg/ml β-elemene (P<0.05).At the meantime,the activity of caspase-3 in EC9706 cells was upregulated by β-elemene.ConclusionThe proliferation of EC9706 cells is inhibited by β-elemene in the concerntration-dependent and time-dependent manner.β-elemene induced apoptosis of EC9706 cells,which might be due to the activation of caspase-3.

【Key words】β-elemene;Human esophageal carcinoma cell;Proliferation;Apoptosis

(收稿日期2015-03-18修回日期 2015-09-22)

中圖分類號：R735.1

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)02-0202-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.02.008

通訊作者：趙怡