三氯生對東北林蛙蝌蚪的急慢性毒性分析

董玉瑛，王　翔，鄒學軍，李曉博

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116605)

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三氯生對東北林蛙蝌蚪的急慢性毒性分析

董玉瑛，王翔，鄒學軍，李曉博

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116605)

摘要：采用靜置馴養-暴露方法測定了東北林蛙蝌蚪在不同質量濃度梯度三氯生中的急、慢性毒性，由劑量-效應關系獲得其24 h-LC50和48 h-LC50值分別為1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48 h最大無致死效應質量濃度為0.8 mg·L-1；進一步測定了蝌蚪暴露在最大無致死效應質量濃度下11 d期間體內的過氧化氫酶活性動力學變化特征。結果顯示，暴露2 d時蝌蚪體內過氧化氫酶活性升高3.5 %，產生了氧化脅迫作用，暴露7 d時過氧化氫酶活性升高49.9 %，達到峰值，之后呈現逐漸降低趨勢但仍高于正常值。鑒于三氯生對蝌蚪的慢性損害和長期毒性明顯存在，其對生態環境的綜合影響將不容忽視。

關鍵詞：三氯生；東北林蛙蝌蚪；急性毒性；亞慢性毒性；過氧化氫酶活性

抗生素、止疼劑、消毒劑、降脂劑和防腐劑等藥品和個人護理品(PPCPs)是與人類關系密切、應用廣泛、種類繁多的一大類新型污染物。由于其全球使用量大，在許多水環境中被檢測的頻率高，研究PPCPs對生物的毒理效應成為了重點關注的方向之一[1-2]。三氯生是一種高效廣譜抗菌劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌以及病毒均有廣泛高效的殺滅抑制作用，被廣泛應用于化妝品、牙膏、香皂等各種清潔衛生產品中[3]。目前針對三氯生的生態毒性研究主要集中在急性毒性研究，而對其長期的生態毒性和受試生物體內酶活的影響研究報道較少，因此，對其進行亞慢性毒性分析并獲得基礎毒性數據對于制定該類化合物的環境標準和安全閾值、評估水生生態環境的風險、預防和處理突發事件具有重要意義[4]。

兩棲動物是整個生態系統食物鏈中的一個重要環節。蛙類是一種重要的兩棲動物，其幼體蝌蚪對水環境變化非常敏感[5-6]，可用于指示水體不同污染程度。本文研究三氯生對東北林蛙蝌蚪的生態毒理效應，可為該化合物環境風險評價提供相關數據。

1材料與方法

1.1　儀器及試劑

CP114型電子天平(奧豪斯儀器廠)；85-2型磁力加熱攪拌器(上海司樂儀器廠)；UV-2600型紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU CORPORATION)；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

三氯生、30 %冰乙酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液pH=6.4(由4 mol·L-1磷酸二氫鈉和1 mol·L-1磷酸氫二鈉配制而成)、20 mmol·L-1H2O2均為分析純。

1.2　方法

1.2.1東北林蛙蝌蚪馴養及預實驗

受試生物采集于大連開發區童牛嶺，經鑒定系為東北林蛙蝌蚪。將其置于24 h曝氣后的自來水中馴養3 d。在暴露實驗前一天不予喂食。以曝氣水為空白對照，配置不同質量濃度梯度的三氯生溶液，按照每升水6尾蝌蚪的比例進行暴露實驗，平行3~5組，實驗期間不投食，記錄24 h和48 h各組蝌蚪的死亡情況，特別觀察零死亡的最大劑量和全部死亡的最小劑量，以便確定正式實驗的質量濃度梯度。

1.2.2三氯生對東北林蛙蝌蚪急性毒性實驗

通過預試驗調整質量濃度梯度，并以同樣的投加方式再次進行試驗，24 h后測一次蝌蚪死亡數量，48 h后測一次蝌蚪死亡數量，最終可以確定三氯生對東北林蛙蝌蚪的半數致死濃度(LC50)。根據水生生物急性毒性試驗標準方法在預試驗得到的質量濃度范圍內，按照等間距的方式，設置三氯生的5組質量濃度梯度(0.2，0.5，0.8，1.1，2.0 mg·L-1)對東北林蛙蝌蚪進行染毒。設空白對照組與平行試驗組，每組中放入8尾蝌蚪，用暴露實驗法，24 h和48 h后紀錄各組蝌蚪的死亡數。

1.2.3三氯生對東北林蛙蝌蚪亞慢性毒性實驗

選用5周齡以上蝌蚪，三氯生藥品質量濃度為0.8 mg·L-1，設置6個實驗組，每組放置10尾蝌蚪，并設置去氯曝氣水的空白對照及平行實驗。分別于0,2,4,7,11,16 d取樣，每組取4尾蝌蚪作為平行，用蒸餾水將其沖洗后迅速擦干，稱重并測量體長、頭圍，觀察其活動狀態。

1.2.4三氯生對東北林蛙蝌蚪的過氧化氫酶(CAT)活性影響[7-8]

將蝌蚪樣品、0.1 g PVPP和20 mL 0.2mol·L-1的磷酸鹽緩沖液混合于研缽中，在冰浴條件下研磨后轉移，以10 000 r·min-1、4℃條件下離心30 min，取上清液置于-80℃保存備用。在25℃條件下，將3 mL 20 mmol·L-1H2O2和500 μL酶液加入試管中迅速搖勻后，以蒸餾水為參比，測240 nm下3 min期間的吸光度值，間隔1s讀數一次。制作混合物的吸光度OD240值隨時間變化曲線，根據線性部分計算每分鐘吸光度變化值△OD240。以每克蝌蚪樣品(鮮重)每分鐘吸光度變化值減少0.01為1個過氧化氫酶活性單位計算過氧化氫酶活性，1個過氧化氫酶活性單位(U)表示為0.01△OD240/min·mg蛋白質。

2結果與討論

2.1　三氯生對東北林蛙蝌蚪急性毒性分析

進行三氯生對東北林蛙蝌蚪24 h和48 h急性毒性分析，數據擬合結果如圖1和圖2。計算獲得24h-LC50為1.578 mg·L-1，48h- LC50為1.102 mg·L-1，折合東北林蛙蝌蚪單位重量對三氯生的48 h毒性承載力LC50為5 510 mg·kg-1。有研究表明，三氯生對小鼠口服喂食情況下單位重量的毒性承載力LC50為3 700 mg·kg-1、腹腔注射條件下單位重量的毒性承載力LC50為89 mg·kg-1，并且已對小鼠具有輕度致畸性，損傷到肌肉功能，引起了肝癌和肝臟纖維化[9]。由此可知，三氯生對兩棲動物和哺乳動物的急性毒性效應顯著。

圖1　三氯生對蝌蚪暴露24 h劑量-效應關系

圖2　三氯生對蝌蚪暴露48 h劑量-效應關系

2.2　三氯生對東北林蛙蝌蚪發育體征影響

觀察三氯生對東北林蛙蝌蚪暴露在最大無致死效應質量濃度為0.8 mg·L-1溶液中11 d期間亞慢性毒性情況如圖3和圖4，顯示了其對蝌蚪體長、頭圍及體重的影響。空白對照組蝌蚪平均體長由2.83 cm增長到3.14 cm，實驗期間尾部逐漸萎縮，16 d后蝌蚪尾部消失變成青蛙；三氯生暴露實驗組蝌蚪平均體長基本無變化，發育緩慢。空白對照組蝌蚪平均頭圍由1.86 cm增到2.04 cm；三氯生暴露實驗組蝌蚪平均頭圍由1.86 cm降到1.66 cm，頭圍明顯變小。空白對照組蝌蚪平均體重由208.1 mg增到251.1 mg，體重呈明顯增長趨勢；三氯生暴露實驗組蝌蚪平均體重由208.1 mg降到112.0 mg，體重顯著減少。三氯生暴露實驗組蝌蚪在暴露期間7 d后陸續出現死亡，且存活的蝌蚪活動性明顯減弱。

圖3　蝌蚪暴露期間體長和頭圍的變化情況

圖4　蝌蚪暴露期間體重的變化情況

Nik Veldhoen等人研究了布洛芬對成長中的中北美牛蛙蝌蚪的毒性效應，發現只要暴露濃度在10-9范圍，即可引起蝌蚪體內和體外培養器官的分子反應。中北美牛蛙蝌蚪在1 5μg·L-1布洛芬環境下暴露6 d，可以改變其肝臟中mRNA轉錄過程[10]。對比研究說明，布洛芬為內服藥物，三氯生多為外用抗菌劑，暴露濃度在10-7范圍中三氯生即可抑制蝌蚪變態發育，對蝌蚪的脅迫性較大。

2.3　三氯生對東北林蛙蝌蚪體內過氧化氫酶(CAT)活性的影響

進行三氯生對東北林蛙蝌蚪在最大無致死效應質量濃度0.8 mg·L-1下暴露11d期間過氧化氫酶活性動力學特征的研究，其體內過氧化氫酶活性變化趨勢見表1。從表1中可以看出，三氯生暴露實驗組過氧化氫酶活性均比空白對照組高，從第2 d到第7 d，三氯生暴露實驗組的過氧化氫酶活性升高較快，7 d后酶活性降低；空白對照組酶活性基本變化不大。無致死質量濃度0.8 mg·L-1三氯生下長時間暴露，可促使蝌蚪體內過氧化氫酶活性增強。由于過氧化氫酶是蝌蚪體內重要的生物防御系統酶，三氯生已經對蝌蚪產生了氧化脅迫作用，誘導過氧化氫酶活性，提高機體抗氧化能力。因此，蝌蚪體內過氧化氫酶活性增強以后，蝌蚪的防御功能增強，抵抗三氯生的脅迫作用增大。但因為三氯生的脅迫作用太大，而致使蝌蚪在未能完全變態發育前大部分死亡。

表1　三氯生對東北林蛙蝌蚪過氧化氫酶活性的影響

呂玥等人研究了壬基酚對中華大蟾蜍蝌蚪的毒性效應，結果表明暴露于0.010 mg·L-1壬基酚的蝌蚪，其生長發育被極顯著抑制；CAT活性表現為先誘導后恢復；處理組DNA損傷水平均顯著高于對照組，具有一定的劑量-效應關系[11]。綜合對比上述實驗數據可知，三氯生對兩棲動物的體內過氧化氫酶(CAT)活性的影響同表面活性劑壬基酚相類似，都會誘導其提高，以增強機體防御機制。

3結論

(1) 采用靜置馴養-暴露方法測定了東北林蛙蝌蚪在三氯生中的急性毒性，由毒性效應-劑量相關關系，獲得 24h-LC50和48 h-LC50毒性效應值分別為1.578 mg·L-1和1.102 mg·L-1，48h最大無致死效應質量濃度為0.8 mg·L-1。

(2) 對蝌蚪長期低濃度的亞慢性毒性實驗表明，三氯生對東北林蛙蝌蚪的體長、頭圍、體重等體征有明顯的抑制作用，在實驗周期11 d期間，其平均頭圍縮小了10.7 %，體重減少了46.1 %，體長變化不明顯，體形變細，蝌蚪無法完成變態發育。

(3) 三氯生對東北林蛙蝌蚪體內過氧化氫酶(CAT)活性的動力學實驗表明，三氯生可對蝌蚪產生氧化脅迫作用，誘導過氧化氫酶活性增大，以提高機體抗氧化能力。但當三氯生的脅迫作用達到一定程度，會致使蝌蚪在未能完全變態發育前大部分死亡。

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(責任編輯鄒永紅)

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《大連民族大學學報》編輯部

2016年1月15日

Analysis on Acute and Sub-chronic Toxicity of

Triclosan to the Northeast Frog Tadpoles

DONG Yu-ying，WANG Xiang，ZOU Xue-jun，LI Xiao-bo

(College of Environment and Resource, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Abstract:In this paper the stationary tested method was adopted to determine the acute and chronic toxicity of triclosan to the northeast frog tadpoles which were exposed to different concentration gradient of triclosan. The acute data were obtained by effects-dose relationship. 24h-LC50is 1.578mg·L-1and 48h-LC501.102mg·L-1respectively. The largest no lethal effect concentration of triclosan to the tadpoles is 0.8mg·L-1. By kinetics test of catalase activity it can be found that the enzyme activity increased 3.5% in 2 days, and reached the maxium value beyond the blank value with 49.9% in 7 days to indicate the oxidative stress effect. It should be pay more attention to chronic damage, long-term toxicity and comprehensive impact on the ecological environment.

Key words:triclosan；northeast frog tadpole；acute toxicity；sub-chronic toxicity；catalase activity

中圖分類號：X503.2

文獻標志碼：A

文章編號：2096-1383(2016)01-0011-04

作者簡介：董玉瑛(1968-)，女，遼寧錦州人，教授，博士，學校優秀學術帶頭人，主要從事新型污染物風險評價研究。

基金項目：國家自然科學 (21477001)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(DC201502070302)。

收稿日期：2015-10-26