珊瑚狀先天性白內(nèi)障一家系致病基因篩查與鑒定

鞏　雪，宋籽潯，肖　偉

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珊瑚狀先天性白內(nèi)障一家系致病基因篩查與鑒定

鞏雪，宋籽潯，肖偉

Gene mapping and analysis of genes in a Chinese family with congenital coralliform cataract

Xue Gong, Zi-Xun Song, Wei Xiao

Citation:Gong X, Song ZX, Xiao W. Gene mapping and analysis of genes in a Chinese family with congenital coralliform cataract.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(2):346-348

摘要

目的:對(duì)一個(gè)珊瑚狀先天性白內(nèi)障家系進(jìn)行致病基因的篩查。

方法:采集家系中2例患者和1例正常對(duì)照者的外周靜脈血，提取基因組DNA。選擇與珊瑚狀白內(nèi)障相關(guān)的候選基因GJA3、GJA8、CRYGC及CRYGD設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增候選基因，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測(cè)序。

結(jié)果:該家系疾病表型為珊瑚狀白內(nèi)障，呈常染色體顯性遺傳。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)家系內(nèi)患者CRYGD第2個(gè)外顯子第70位有1個(gè)C>A堿基的雜合突變(c.70C>A)，正常對(duì)照未見(jiàn)該點(diǎn)突變。

結(jié)論:CRYGD基因的錯(cuò)義突變c.70C>A是該珊瑚狀白內(nèi)障家系的致病原因。

關(guān)鍵詞：珊瑚狀白內(nèi)障；CRYGD；基因測(cè)序

引用：鞏雪，宋籽潯， 肖偉.珊瑚狀先天性白內(nèi)障一家系致病基因篩查與鑒定.國(guó)際眼科雜志2016;16(2):346-348

0 引言

先天性白內(nèi)障(congenital cataract)是指出生時(shí)或出生后1a之內(nèi)發(fā)生的晶狀體混濁，可為家族性或散發(fā)性，可伴發(fā)或不伴發(fā)其他眼部異常或系統(tǒng)疾病。先天性白內(nèi)障是造成兒童弱視或失明的主要原因。目前，先天性白內(nèi)障發(fā)病率約為0.01%~0.06%[1]。遺傳、病毒感染、藥物和放射線照射、全身疾病等各種影響胎兒晶狀體發(fā)育的因素都可導(dǎo)致白內(nèi)障，其中約1/3的先天性白內(nèi)障與遺傳因素有關(guān)。本研究對(duì)東北遼沈地區(qū)一個(gè)特殊表型的珊瑚狀白內(nèi)障家系的致病基因進(jìn)行篩查與鑒定，以期找到致病基因及位點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象本試驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，我們收集了一個(gè)來(lái)自中國(guó)東北遼沈地區(qū)的三代先天性白內(nèi)障家系，經(jīng)詳細(xì)的家系病史調(diào)查，繪制系譜圖后確定遺傳方式為常染色體顯性遺傳。我們對(duì)全部家庭成員進(jìn)行詳細(xì)的眼部檢查，包括裂隙燈檢查、視力、驗(yàn)光、眼壓、眼底檢查。我們收集3例家系成員(Ⅱ1，Ⅱ2，Ⅲ1)靜脈血各5mL于EDTA抗凝真空管內(nèi)，-20℃保存。

1.2方法選取候選基因：檢索OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，選取了4個(gè)與珊瑚狀白內(nèi)障密切相關(guān)的基因GJA8、GJA3、CRYGC、CRYGD進(jìn)行篩查。從UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)獲取候選基因序列，以Primer Premer6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由北京梓熙生物公司合成。

候選基因直接測(cè)序分析：用DNA提取試劑盒QIAamp Blood kit(QIAGEN公司)提取家系成員DNA，-4℃保存。體外擴(kuò)增目的片段：PCR反應(yīng)體系為25μL，其中DNA1 μL，LA Taq聚合酶12.5μL，ddH2O 9.5μL，正、反向引物各1μL。PCR反應(yīng)條件設(shè)為：98 ℃預(yù)變性1min；98℃變性10s；退火60℃ 30s；延伸72℃ 1min；循環(huán)30次，然后72℃延伸10min。4℃保存。檢測(cè)PCR產(chǎn)物：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠在120V恒壓下電泳5~10min，由北京梓熙生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與UCSC 基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析，檢查各基因序列有無(wú)堿基發(fā)生改變。

表1　家系1候選篩查基因外顯子PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1家系成員遺傳特點(diǎn)和臨床表型經(jīng)詳細(xì)的病史詢問(wèn)，5例家系成員中3例患病，其中女2例，男1例，繪制系譜圖呈常染色體顯性遺傳(圖1)。先證者晶狀體混濁雙眼受累，白內(nèi)障表型特殊：晶體點(diǎn)片狀混濁從后極部中央向前方呈放射狀分布，中央部密集，周邊分散，形似珊瑚(圖2)。未發(fā)現(xiàn)家系內(nèi)患者眼部其他疾病及全身系統(tǒng)疾病。

2.2候選基因突變分析3例家系成員候選基因直接測(cè)序分析后，發(fā)現(xiàn)所有患者的CRYGD的第2個(gè)外顯子的第70位堿基C被A替換，該點(diǎn)突變導(dǎo)致第24位的脯氨酸(P)被蘇氨酸(T)替代(圖3)，而家系中的正常個(gè)體未發(fā)生此突變，突變位點(diǎn)與核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，排除了SNP的可能，家系中表型與基因型共分離。

3 討論

大約1/3的先天性白內(nèi)障發(fā)生與遺傳缺陷有關(guān)，主要有三種遺傳方式：常染色體顯性遺傳(autosomal dominant, AD)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive, AR)和X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive, XR)，其中常染色體顯性遺傳最常見(jiàn)。先天性白內(nèi)障的晶狀體混濁部位及形態(tài)不一，本試驗(yàn)家系表型是較為罕見(jiàn)的珊瑚狀白內(nèi)障，晶狀體點(diǎn)片狀混濁從后極部中央向前方呈放射狀分布，中央部密集，周邊分散，形似珊瑚。2002年Santhiya等[2]首先將一印度板層狀先天性白內(nèi)障家系致病基因突變定位于CRYGD(c. 70C>A)，之后該錯(cuò)義突變?cè)诓煌N族背景中陸續(xù)被報(bào)道，該點(diǎn)突變導(dǎo)致的先天性白內(nèi)障表型還有珊瑚狀[3]、束狀[4]、核性[5]、藍(lán)色花冠狀[6]和皮刺狀白內(nèi)障[7]。這些研究表明，CRYGD 基因的c. 70C>A(p.Pro24Thr)突變導(dǎo)致的白內(nèi)障表型具有明顯的臨床異質(zhì)性，而即使同為珊瑚狀表型也可因晶狀體混濁形態(tài)和程度不同而存在一定差別。

目前，已經(jīng)明確與常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障相關(guān)的基因主要有四類：(1)晶狀體蛋白基因：CRYAA、CRYAB、CRYBA1/A3、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYGC、CRYGD、CRYGS；(2)膜蛋白基因：MIP、GJA3、GJA8；(3)調(diào)節(jié)眼球發(fā)育基因：PITX3、PAX6、MAF；(4)其它基因：BFSP2、HSF4、EPHA2、FTL、CHMP4B。人晶狀體內(nèi)90%的可溶性蛋白為晶狀體蛋白，由α、β、γ晶狀體蛋白基因編碼，其中γ晶狀體蛋白占25%。γ-D晶狀體基因是胚胎期晶狀體細(xì)胞高表達(dá)的基因，其編碼的人類的γ-D晶狀體蛋白是一種高度穩(wěn)定的可溶性蛋白，γ-D晶狀體蛋白對(duì)于維持晶狀體透明性和屈光性非常重要。晶狀體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變有可能導(dǎo)致蛋白穩(wěn)定性和水溶性下降，出現(xiàn)晶體混濁，臨床上表現(xiàn)為白內(nèi)障。目前報(bào)道CRYGD基因有17種點(diǎn)突變與先天性白內(nèi)障相關(guān)[2，8-23]。

圖1遺傳性白內(nèi)障家系系譜圖。

圖2先天障家系先證者圖片A：左眼；B：右眼。

圖3ADCC家系中非患者與患者CRYGD基因測(cè)序結(jié)果，箭頭所示為突變位點(diǎn)c.C70A。

本試驗(yàn)將該家系的致病位點(diǎn)定位于CRYGD基因的c. 70C>A。目前對(duì)于該突變導(dǎo)致遺傳性先天性白內(nèi)障的機(jī)制研究主要圍繞突變蛋白結(jié)構(gòu)及功能展開(kāi)。γ-D晶狀體蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由包含4個(gè)反向β折疊的“Greek key”組成。γ-D晶狀體蛋白的第24位的脯氨酸位于第一個(gè)Greek key的N-末端結(jié)構(gòu)域[24]，Evans等[25]發(fā)現(xiàn)第24位氨基酸殘基改變可使邊緣的β鏈延伸，使β折疊含量增加，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 徐偉珍等[26]發(fā)現(xiàn)P24T突變使非極性的脯氨酸被極性的蘇氨酸取代，蘇氨酸游離的羥基暴露于蛋白大分子表面，使分子間形成氫鍵的可能性增加，這一變化可能影響突變體γ-D晶狀體蛋白與其他蛋白質(zhì)之間的相互作用。Jung等[27]發(fā)現(xiàn)P24T突變體局部構(gòu)象與野生型不同，推測(cè)24位脯氨酸被蘇氨酸替代后啟動(dòng)聚合，使溶解度降低和形成了高分子量復(fù)合物。Shentu 等[4]認(rèn)為CRYGD(P24T)突變使晶狀體細(xì)胞內(nèi)球狀高密度沉積物增加，造成晶狀體混濁。Yao等[28]發(fā)現(xiàn)突變改變了氨基酸殘基之間的氫鍵長(zhǎng)短和彎曲度，使蛋白質(zhì)功能受影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，CRYGD基因第2個(gè)外顯子中第70位堿基發(fā)生C→A的改變使24位脯氨酸變?yōu)樘K氨酸(p.Pro24Thr)，這是該珊瑚狀白內(nèi)障家系的分子學(xué)致病基礎(chǔ)，也為先天性白內(nèi)障患者展開(kāi)基因診斷和基因治療奠定基礎(chǔ)。

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Foundation items:National Natural Science Foundation of China(No.30973276);Scientific Research Project of Liaoning Education Department(No.L：2015593)

Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to:Wei Xiao. Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. xiaow@sj-hospital.org

Received：2015-09-29Accepted：2016-01-15

Abstract

?AIM:To detect the causative mutation for congenital coralliform cataracts in a Chinese family.

?METHODS:Peripheral blood samples were collected and genomic DNA was extracted. We chose four candidate genes associated with congenital coralliform cataract including GJA3,GJA8,CRYGC and CRYGD. After genomic polymerase chain reaction (PCR) performed, we sequenced the coding exons and their flanking intronic sequences of four candidate genes.

?RESULTS:We ascertained a three-generation Chinese family with autosomal dominant coralliform congenital cataracts. Mutation screenings were performed for all four candidate genes, and a heterozygous variant, c.70C>A,was identified in exon 2 of CRYGD.

?CONCLUSION:Our result demonstrates that a heterozygous mutation of CRYGD is responsible for the autosomal dominant congenital coralliform cataract in a three-generation Chinese pedigree.

KEYWORDS:?coralliform cataract;gamma-D crystallin gene;gene sequencing

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.2.40

收稿日期：2015-09-29 修回日期： 2016-01-15

通訊作者：肖偉，醫(yī)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：白內(nèi)障.xiaow@sj-hospital.org

作者簡(jiǎn)介：鞏雪，在讀碩士研究生,研究方向：白內(nèi)障。

基金項(xiàng)目：作者單位：(110004)中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科