β-環糊精液相色譜固定相拆分和測定梨中烯唑醇對映體含量

曹志剛,李來生,2*，程彪平,張宏福,曾　春,譙　婷

(1.南昌大學　化學學院，江西　南昌　330031；2.南昌大學　分析測試中心，江西　南昌　330047)

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β-環糊精液相色譜固定相拆分和測定梨中烯唑醇對映體含量

曹志剛1,李來生1,2*，程彪平1,張宏福1,曾春1,譙婷1

(1.南昌大學化學學院，江西南昌330031；2.南昌大學分析測試中心，江西南昌330047)

摘要：制備了一種單脲基衍生化β-環糊精鍵合有序介孔SBA-15手性固定相(UCDP)，并將其填充于色譜柱中，以甲醇和水為流動相，成功地拆分了手性農藥烯唑醇對映體。考察了流動相組成和溫度等因素對手性分離的影響，確定最佳條件為：流動相為甲醇-水(40∶60)，流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃，檢測波長248 nm。在優化分離的基礎上，建立了一種高效液相色譜快速測定梨中烯唑醇對映體殘留量的新方法。梨樣品經乙腈提取，氨基固相萃取柱凈化后按上述條件測定。單個烯唑醇對映異構體在0.5~125 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。梨樣品中分別添加1.25 μg/mL和5.0 μg/mL兩水平的烯唑醇對映體，測得R-烯唑醇的平均回收率分別為92.0%和94.4%，S-烯唑醇的平均回收率分別為91.2%和92.8%。按3倍于噪音信號推算得到單個烯唑醇的檢出限為0.02 μg/mL。該環糊精類固定相的自制方法簡便，脲鍵固定相更穩定，制備成本較低。所建立的對映體分析方法快速、準確、重現性好，在梨等果蔬樣品中農藥對映體殘留量檢測方面有良好的應用前景。

關鍵詞：高效液相色譜法；環糊精手性固定相；烯唑醇對映體；手性農藥；食品安全

分子中含有不對稱的原子、不對稱中心、不對稱面的化合物均可能具有手性(Chirality)，手性是自然界物質的基本屬性之一。除對偏振光作用后結果不同外，對映體的其他物理性質和化學性質幾乎相同，但在與手性的生命系統作用時常表現出明顯的差異[1-2]。近年來，手性農藥對映異構體的殺蟲活性、生物毒性、體內代謝的差異性越來越受到國際社會的高度重視。例如：除草劑異丙甲草胺，其S-型對映體有很好的除草活性，而R-型對映體不僅無除草活性，還有致癌作用[3]。常見的三唑類手性農藥對映體不僅殺菌活性不同，對大鼠的肝臟毒性也不同，已被美國環境保護署(EPA)列為潛在的手性致癌物[4-5]。因此，研發新型的手性固定相，并建立測定手性農藥對映體含量的新方法，對深入了解對映體的殺菌活性和人體毒性，乃至對食品安全均具有重要的研究意義。

在使用的化學農藥中有40%以上含有手性結構，三唑類殺菌劑是典型代表，它們被廣泛地用于農業生產、果蔬保鮮和食品工業中。烯唑醇(Diniconazole )是一種常用的三唑類農藥殺菌劑[6]，分子式為C15H17Cl2N3O，化學名稱為(E)-(R,S)-1-(2,4-二氯苯基)-4,4-二甲基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)戊-1-烯-3-醇，又名速保利，其化學結構見圖1。烯唑醇是集保護、治療、鏟除作用于一體的廣譜性殺菌劑，在真菌的麥角甾醇生物合成中通過抑制14α-脫甲基化而產生殺菌效果。烯唑醇的R-對映體表現出殺菌作用，而S-對映體卻表現出植物調節劑的作用[7]。由于手性農藥對映體功效和毒性不同，對其對映體進行拆分并測定含量很有必要。

目前，該類手性農藥對映體的拆分方法研究主要集中在非手性測定，手性對映體含量的測定方法報道較少。手性拆分主要包括超臨界流體色譜法[8-9]、毛細管電泳法[10-12]和高效液相色譜法[13-18]。Toribio等[8]采用衍生化直鏈淀粉柱，向超臨界二氧化碳流體中添加不同的醇，成功地拆分了烯唑醇對映體。Ibrahim等[10]采用27 mmol/L羥丙基β-環糊精、3 mmol/L羥丙基γ-環糊精和40 mmol/L十二烷基磺酸鈉(SDS)毛細管膠束電泳(MEKC)拆分了烯唑醇對映體。楊麗等[13]以衍生化β-環糊精為手性添加劑，在C8柱上拆分了己唑醇對映體，但由于流動相需消耗貴重的手性添加劑，實際應用十分有限。采用手性固定相的高效液相色譜法是拆分三唑類農藥對映體更為有效的手段。Wang等[14]使用涂覆型的3,5-二甲苯氨基甲酸酯化纖維素固定相，以正己烷-異丙醇為流動相，將柱溫下降至0 ℃時拆分了5種農藥對映體，但溶質被洗脫的時間較長。韓小茜等[15]采用上述同類型的纖維素柱拆分了烯唑醇等對映體，考察了流動相組成和溫度對分離度的影響，并計算了相關熱力學參數，發現在15~25 ℃之間分離受焓控制，在25~40 ℃之間分離受熵控制。環糊精(Cyclodextrins)含有規整的手性碳和腔體，通過包結作用對許多化合物顯示出手性分離能力[19]。與常用的涂覆型纖維素固定相相比，性能更穩定，自制的環糊精手性柱可節約成本，并適用于反相色譜分離模式。

本文制備了一種新型含有穩定的單脲基衍生化的β-環糊精鍵合的SBA-15液相色譜手性固定相，這種有序介孔固定相渦流擴散小，傳質快，單脲基衍生化的β-環糊精配體對烯唑醇對映體的選擇性好，用簡單的甲醇-水流動相即可快速洗脫溶質，有良好的手性分離應用前景。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Waters ZQ-2695高效液相色譜質譜聯用儀，配有2996型二極管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx 4.1(美國Waters公司)；5700 型傅立葉紅外光譜儀( 美國Nicolet 公司) ;Vario EL Ⅲ元素分析儀(德國Elementar公司)；AW-60色譜裝柱機(美國Haskel公司)；Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；DS-1高速組織搗碎機(上海標本模型廠)；HSC-12A氮吹儀(南京科捷分析儀器有限公司)；MS-3迷你振蕩器(德國IKA公司)；TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；KQ-100E型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-2集熱式磁力攪拌器(金壇市鑫鑫實驗儀器廠)；ZKF-030型電熱真空干燥箱(上海實驗儀器總廠)。

三嵌段聚合物P123(MW~5 800)、正硅酸乙酯(TEOS)、β-環糊精(β-CD)、異氰酸丙基三乙氧基硅烷、異氰酸苯酯均購于Sigma公司；6-單乙二胺基β-環糊精(分析純，山東濱州智源生物科技有限公司)；1,3,5-三甲苯(TMB)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(分析純，阿拉丁試劑公司)，DMF使用前經氫化鈣除水處理；烯唑醇外消旋標準品(純度≥99%，上海農藥研究院)；甲醇(MeOH,色譜純，美國Tedia公司) ；二氯甲烷、氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水。Welchrom氨基柱(1 000 mg/ 6 mL，月旭材料科技上海有限公司)；梨樣品從市場隨機購買。

1.2脲基衍生化β-環糊精鍵合相的制備

使用實驗室前期自制的有序介孔二氧化硅SBA-15[20]，以三嵌段聚合物P123作模板，正硅酸乙酯(TEOS)作硅源，1,3,5-三甲苯(TMB)為擴孔劑，在酸性條件下經水熱合成法制備SBA-15。SBA-15為孔徑分布約20~30 nm，粒徑2.0~4.5 μm，比表面積420 m2/g的類球形顆粒。含脲基的乙二胺環糊精類鍵合相(UCDP)的制備路線見圖2。主要合成過程如下：準確稱取1.4 g干燥的6-單乙二胺基β-環糊精(A)，在磁力攪拌下溶于30 mL無水DMF中，在冰浴中緩慢滴加0.3 mL異氰酸丙基三乙氧基硅烷后，室溫下繼續攪拌反應6 h得到產物(B)。然后，向上述溶液中加入2.5 g SBA-15，升溫至110 ℃繼續反應24 h，過濾后得到粗產品。將粗產品反復用DMF、甲醇、丙酮洗滌至濾液澄清，并用丙酮作為溶劑索氏提取12 h，固體于50 ℃真空干燥12 h，得到單脲基衍生化β-環糊精固定相產品(C)。

1.3色譜柱的填裝

稱取一定量的環糊精固定相，加入丙酮，超聲使固定相均勻分散。以甲醇為頂替劑，在恒壓(34.5 MPa)下，將手性固定相裝填入一根不銹鋼色譜柱中(4.6 mm I.D.×150 mm)。新柱用甲醇和水反復沖洗，最后用流動相平衡，直至基線穩定后進樣分析。以聯苯為溶質，甲醇-水(35∶65)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長254 nm，測得柱效為 23 758塊/m。

1.4標準溶液的配制

準確稱取一定量的外消旋烯唑醇標準品，用甲醇配成1 000 μg/mL的儲備溶液，即含每個對映體500 μg/mL，于4 ℃避光保存。臨用前從冰箱中取出，恢復至室溫，搖勻，用移液槍精密移取一定量的儲備液，用甲醇稀釋至刻度，得到所需濃度的烯唑醇標準溶液，超聲脫氣，過0.22 μm有機相濾膜后進樣分析。

1.5色譜方法

衍生化β-環糊精手性色譜柱(4.6 mm I.D.×150 mm)。流動相為不同體積比的甲醇-水或乙腈，使用前經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣10 min。流速為0.5 mL/min，檢測波長為248 nm，柱溫為25 ℃(298 K)，進樣量為10 μL。所有樣品至少平行測定兩次。

1.6樣品前處理方法

參考相關文獻進行提取、凈化[21]。選取新鮮的梨試樣切片，用打碎機將梨磨成果漿。分別稱取梨試樣10.00 g于3個50 mL離心管(1號、2號、3號)中，在1號離心管中不加外消旋烯唑醇標準樣品(空白)；在2號離心管中加1.0 mL 25 μg/mL的外消旋烯唑醇標準樣品(樣品1)；在3號離心管中加1.0 mL 100 μg/mL的外消旋烯唑醇標準樣品(樣品2)。攪勻，作為模擬樣品，并用于回收率實驗。

然后分別加入20.0 mL乙腈，混勻，加入3.0 g氯化鈉，振搖1 min，離心5 min，吸取乙腈液10.0 mL，在氮吹儀上吹干，加入2.0 mL甲醇-二氯甲烷(5∶95)溶解殘渣。用5.0 mL甲醇-二氯甲烷(5∶95) 預淋洗氨基小柱，待液面快干時，將溶解殘渣的溶液加入氨基小柱中，然后用10.0 mL甲醇-二氯甲烷(5∶95)洗脫，洗脫液經氮吹儀吹干后，用5.0 mL甲醇定容,0.22 μm有機膜過濾，待測。

2結果與討論

2.1固定相的元素分析及紅外光譜表征

對干燥后的固定相進行元素分析，結果為：C,3.24%；H,1.08%；N,0.29%。根據碳含量計算出固定相的鍵合量約為0.13 μmol/m2。

2.2脲基β-環糊精鍵合相拆分烯唑醇對映體

為提高環糊精配體的鍵合量和手性色譜性能，多采用全衍生化環糊精作為手性配體。但全衍生化常會導致環糊精端口部分堵塞，影響腔體的包結作用，降低拆分效果。為此，本實驗制備了脲基單衍生化的β-環糊精鍵合固定相。脲基既是衍生化基團又是穩定的鍵合臂，一方面，含脲鍵的環糊精固定相更穩定；另一方面，脲基是典型的氫鍵接受體，易與烯唑醇手性碳的羥基產生氫鍵作用，這種端口的氫鍵作用有助于環糊精通過腔體包結作用識別烯唑醇的左旋體和右旋體，使得脲基衍生化環糊精固定相對烯唑醇有更好的拆分能力。采用6-乙二胺單取代β-環糊精作手性配體，通過活潑的異氰酸丙基三乙氧基硅烷偶聯劑，可方便地制備穩定的脲基環糊精固定相。由于鍵合臂較長，環糊精配體能更有效地與烯唑醇對映體作用，采用簡單、價廉的甲醇-水即可達到拆分目的。

表1　不同流動相中烯唑醇(柱溫298 K)對映體的分離度

2.2.1流動相的選擇烯唑醇對映體的結構很相似，拆分較困難，為了實現良好的拆分，首先需優化流動相的組成。本實驗采用反相色譜，嘗試用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸三乙銨(TEAA)等作流動相，發現在脲基環糊精柱上采用常見的甲醇-水作為流動相可拆分烯唑醇。為降低測試成本，本實驗選用甲醇-水為流動相，考察了不同體積比的甲醇-水流動相對分離結果的影響，結果見表1。由表1可以看出，隨著甲醇比例的提高，洗脫速度加快，烯唑醇的出峰時間變短，與反相色譜分離行為相一致。與此同時，手性分離度變差，這是因為溶質的洗脫加快，溶質與固定相脲基環糊精配體之間的包結作用變差，環糊精與兩對映體形成包結物的穩定性差別縮小，導致分離度下降。當甲醇-水的比例為30∶70 和25∶75時，對映體的出峰時間分別為41.82，45.23 min和75.45,80.24 min，出峰時間過長，分析速度較慢，且峰展寬，分離度未得到進一步改善。當甲醇-水的比例為40∶60時，R-和S-烯唑醇對映體的保留時間分別為14.42，15.76 min，分離度相對較大(1.56)，且分析時間不超過20 min，表明流動相中含40%甲醇時可兼顧“洗脫速度較快”和“分離度較好”。因此，本實驗選擇甲醇-水(40∶60)作流動相，進一步優化其他色譜條件。

2.2.2流速的選擇考察了流動相流速分別為0.3,0.5,0.7，1.0 mL/min時的分離效果。結果表明，較高的流速使烯唑醇對映體與色譜柱作用力不夠甚至來不及作用，隨著流動相而快速流出色譜柱，分離度不理想；當流速較低時，雖然有足夠的時間和色譜柱作用達到理想的分離度，但大大延長了分析時間。綜合考慮分離度和分析時間，選擇最佳流速為0.5 mL/min。

表2　不同柱溫下烯唑醇對映體的分離結果

2.2.3 柱溫的選擇溫度的變化可能引起手性固定相手性空腔中的構象發生變化，導致對映體的選擇性發生變化[22]。考察了柱溫分別為298,303，308，313，318 K時的分離效果，結果如表2。結果表明，在溫度較低條件下，烯唑醇的兩種對映體分離較好。隨著溫度升高，出峰時間變短，但分離度降低，雖然在298 K柱溫下出峰時間較長，但時間在20 min以內，能滿足高效的原則，所以選擇298 K為優化的柱溫。

2.2.4檢測條件的選擇用紫外檢測器對烯唑醇標準品做多波長掃描，發現在波長200,248 nm處均有較強的紫外吸收，但由于甲醇流動相在200 nm左右也有吸收，而248 nm處則僅為烯唑醇的紫外吸收峰，因此實驗設置檢測波長為248 nm。

2.2.5進樣量的優化分別選擇進樣量為1，2，3，5，10，15，20 μL以考察進樣量對分離效果的影響。實驗結果顯示，進樣量低時，流動相對烯唑醇的分離檢測信號干擾較大，基線不穩定；進樣量較高時，基線平穩，分離度也可滿足分析要求。所以，實驗選擇進樣量為10 μL，可減少樣品對色譜柱的污染。

綜合以上研究，確定優化的手性分離色譜條件為：流動相為甲醇-水(40∶60,體積比)，流速0.5 mL/min，柱溫298 K，檢測波長248 nm，進樣量10 μL。在優化的色譜條件下對烯唑醇對映體進行拆分，能達到基線平穩的較好分離(圖4)，同時拆分時間短，分離度為1.56，柱子選擇因子為1.13。

2.3標準曲線的繪制

用甲醇適當稀釋烯唑醇儲備液，配制外消旋烯唑醇濃度分別為1.0，5.0，25，125，250 μg/mL標準儲備液，配制每個對映體的工作濃度分別為0.5，2.5，12.5，62.5，125 μg/mL。將烯唑醇對映體標準溶液按最佳色譜分離條件進行測定，自動進樣從低濃度到高濃度進行手性分離。以烯唑醇對映體的峰面積(y)為縱坐標，相應濃度(x，μg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸。結果表明，烯唑醇對映體在0.5 ~125 μg/mL范圍內線性關系良好，其中R-對映體：y1=2 407.04x1+2 410.31,r1=0.999 0；S-對映體：y2=2 839.01x2+2 171.47，r2=0.999 1。以3倍信噪比計算得檢出限(S/N=3)為0.02 μg/mL。

2.4回收率實驗

按照“1.6”方法分別進行單個對映體濃度為1.25,5.0 μg/mL 2個加標水平的回收率實驗，每個水平連續測定4次。以測得量的平均值與加入量之比計算平均回收率(表3)。結果顯示，該方法有較高的回收率，梨基質中R-烯唑醇的平均回收率為92.0%~94.4%，S-烯唑醇的平均回收率為91.2%~92.8%。梨樣品空白和添加烯唑醇后樣品的色譜圖見圖5。

表3　梨樣品中R- 和S- 烯唑醇的平均回收率(n=4)

2.5樣品重現性實驗

對添加烯唑醇的樣品進行前處理后重復測定。結果顯示，R- 和S- 對映體保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為0.17%和0.44%，對映體峰面積的RSD分別為1.4%和1.7%，方法的重現性較好。

3結論

本研究以有序介孔SBA-15為基質，制備了脲基衍生化的β-環糊精手性固定相(UCDP)，并將其填充于高效液相色譜柱中用以烯唑醇拆分，這種新型的方法能夠較好地拆分烯唑醇對映體，分離時間約20 min，方法的重復性好，且色譜柱為自制的環糊精類色譜柱，成本較低，為手性農藥的單個對映體殘留量的檢測提供了一種兼具快速、高效、簡便、價廉等優點的新型拆分方法，為食品安全分析創造了條件。

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中美科學家合作研獲單原子厚度“硼烯”

一個困擾世界凝聚態物理和材料物理界多年的難題近期被攻克。南開大學和美國阿貢國家實驗室、紐約州立大學石溪分校、美國西北大學的科學家合作，首次獲得了只有單原子厚度的二維硼材料——“硼烯”。該材料因其優越的電學、力學、熱學屬性，被科學界寄予厚望，或將成為繼石墨烯之后又一種“神奇納米材料”。相關研究發表在《科學》雜志并被重點推薦。

作為一種呈蜂巢狀排列的單層碳原子結構，石墨烯是目前已知最薄、最堅硬的納米材料，具有優良的物理化學性能，已被廣泛應用于超級計算機、光子傳感器等領域。繼石墨烯之后，科學家希望找到更多具有優良特性的二維材料。元素硼因是碳的“近鄰”而成為首要目標。然而，硼烯并非自然存在，只能人工合成。科學家對硼烯的理論結構預測已有10年之久，但從未成功合成。硼烯的制備成為國際凝聚態物理及材料物理學界公認的世界難題。

2014年，南開大學周向鋒教授、王慧田教授和紐約州立大學石溪分校奧甘諾夫教授等基于進化算法結合第一性原理計算，預測了一個獨特的二維硼結構。美國阿貢國家實驗室、南開大學、紐約州立大學石溪分校和西北大學等研究單位共同合作，利用高真空原子濺射的方法，首次在銀的表面成功“生長”出褶皺的單原子層硼烯。聯合團隊獲得的實驗結果與理論模型幾乎完全符合。南開大學科研團隊承擔了該研究的理論計算工作。

介紹該成果的評論文章《撥開最薄硼烯的迷霧》同期刊登于《科學》雜志。《自然》雜志也刊發題為《單原子層硼烯加入二維材料俱樂部》的報道。

(信息來源：光明日報)

Separation and Determination of Diniconazole Enantiomers in Pear onβ-Cyclodextrin-based Stationary Phase by HPLCCAO Zhi-gang1,LI Lai-sheng1,2*,CHENG Biao-ping1,ZHANG Hong-fu1,ZENG Chun1,QIAO Ting1

(1.College of Chemistry,Nanchang University,Nanchang330031,China;2.Center of Analysis Testing,

Nanchang University,Nanchang330047,China)

Abstract：A new mono-ureado β-cyclodextrin-bond ordered mesoporous SBA-15 chiral stationary phase(UCDP) was prepared and packed into the column.With common methanol-water as mobile phase,the chiral pesticide diniconazole enantiomers was successfully separated by using UCDP.Effects of mobile phase composition and temperature on the chiral separation were investigated.The optimized chromatographic conditions for diniconazole enantiomers were as follows:mobile phase:methanol-water(40∶60),flow rate:0.5 mL/min,column temperature:25 ℃,detection wavelength:248 nm.Based on the above separation conditions,an HPLC method for the rapid determination of diniconazole enantiomer residues in pear was established.The pear samples were extracted with acetonitrile and purified with amino solid extraction column,and determined on UCDP in the above conditions.The good linear relationships for two enantiomers were observed in the range of 0.5-125 μg/mL.The average recoveries of the analytes in pear samples at two spiked concentration levels of 1.25 μg/mL and 5.0 μg/mL were in the ranges of 92.0%-94.4%for R-enantiomer,and 91.2%-92.8%for S-enantiomer,respectively.According to the signal-to-noise of 3(S/N=3),the detection limits of diniconazole enantiomers were 0.02 μg/mL.The UCDP preparation method is simple,and the stationary phase with urea group is stable.The developed method is rapid,accurate and reproducible,and has a good application prospect in the determination of chiral pesticide residues in fruits and vegetables.

Key words：high-performance liquid chromatography(HPLC);cyclodextrin-based chiral stationary phase;diniconazole enantiomer;chiral pesticides;food safety

中圖分類號：O657.72;F767.2

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)01-0016-07

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.003

通訊作者：*李來生，博士，教授,研究方向：色譜分析與生化分析，Tel：0791-88304414，E-mail:lilaishengcn@163.com

基金項目：國家自然科學 (21165012)；江西省自然科學 (2010GZH0089)；江西省教育廳科技項目(GJJ11274)

收稿日期：2015-07-08；修回日期：2015-07-29