脾氣虛和脾陽虛模型大鼠空腸組織葡萄糖轉運體5表達水平變化的實驗研究

尚 冰，叢培瑋，王艷杰，趙丹玉，馮曉帆，張 林

脾氣虛和脾陽虛模型大鼠空腸組織葡萄糖轉運體5表達水平變化的實驗研究

尚 冰，叢培瑋，王艷杰，趙丹玉，馮曉帆，張 林

【摘要】目的建立脾氣虛、脾陽虛模型，觀察大鼠空腸組織葡萄糖轉運體(GLUT)5表達水平變化，以探討不同階段脾虛能量代謝的實質與差異。方法2015年3—9月，選取SPF級雄性SD大鼠24只，按照隨機數字表法分為對照組、脾氣虛組、脾陽虛組，每組8只。脾氣虛模型的建立采用飲食失節結合勞倦過度的原則，脾陽虛模型則在脾氣虛的基礎上施加苦寒瀉下法建立。觀察大鼠一般體征狀態(體質量、體溫、進食量等)、前肢抓力(肌力檢測)、行為學變化(曠場實驗)對模型進行評價。采用實時定量熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定GLUT5 mRNA表達水平，Western blotting法測定GLUT5表達水平。結果脾氣虛組體質量、進食量、前肢抓力均低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組體質量、體溫、進食量、前肢抓力均低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組體溫低于脾氣虛組(P<0.05)。脾氣虛組中心區域、周邊區域停留時間長于對照組，角落區域停留時間短于對照組(P<0.05)；脾陽虛組中心區域、角落區域、周邊區域停留時間均短于對照組、脾氣虛組(P<0.05)。對照組、脾氣虛組、脾陽虛組角落區域、周邊區域停留時間均長于中心區域(P<0.05)；脾氣虛組、脾陽虛組周邊區域停留時間長于角落區域(P<0.05)。脾氣虛組、脾陽虛組GLUT5 mRNA、GLUT5表達水平低于對照組(P<0.05)；脾陽虛組GLUT5 mRNA表達水平低于脾氣虛組(P<0.05)。結論脾虛狀態下，大鼠空腸組織GLUT5 mRNA及其蛋白表達水平均降低，這可能是脾氣虧虛、能量代謝障礙的重要分子機制之一。

脾氣虛和脾陽虛是脾虛不同的發展階段。初期脾氣虛后，常會累及脾臟陽氣，產生虛寒癥狀，脾陽虛較脾氣虛病情更加深入。脾胃因其“后天之本、氣血生化之源”的地位，被認為是人體生命活動、能量來源的基礎保障[1]。大量研究發現，人類攝入的碳水化合物大部分在小腸上皮被分解為單糖，通過小腸上皮吸收轉運進入血循環，從而提供機體的絕大部分能量，其在體內代謝首先需要進入細胞，這一過程需要依賴一種葡萄糖轉運體(glucose transporter，GLUT)來完成[2]。而這種吸收-轉運-入血的簡單過程卻提供了絕大部分人體每日生存所必需的糖類物質[3]。目前，關于脾虛本質的研究諸多[4]，但針對脾虛患者臨床主要出現的思慮勞倦、精神氣血日虧等一系列“神疲乏力”等能量代謝的脾虛本質探討的相關報道鮮見。本研究以脾氣虛、脾陽虛模型大鼠為載體，通過肌力檢測和曠場實驗對“神疲乏力”進行量化評價，同時通過觀察不同模型大鼠空腸組織GLUT5表達水平，探討不同階段脾虛能量代謝的實質與差異，以期為脾虛的臨床治療提供新的靶點。

1材料與方法

1.1實驗動物2015年3—9月，選取SPF級雄性SD大鼠24只〔由本溪實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(遼)2010-0001〕，體質量(200±10)g，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心。

1.2主要試劑和儀器RNAiso Plus試劑盒、實時定量熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒(Takara公司)；兔抗大鼠GLUT5(一抗)、羊抗兔IgG(二抗)(Abcam公司)；三羥甲基胺甲烷緩沖液(TBST)、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TM-Vision行為學實驗系統(成都泰盟軟件有限公司)；YLS-13A大小鼠抓力測定儀(濟南益延科技發展有限公司)；7500 RT-PCR儀(ABI公司)。

1.3動物分組、模型建立和評價24只大鼠按照隨機數字表法分為對照組、脾氣虛組、脾陽虛組，每組8只。脾氣虛、脾陽虛模型的建立和評價參考筆者的前期報道[5]，在此基礎上本課題組進行了改良設計，具體如下：(1)對照組：相同室溫及濕度環境，自由飲水進食。(2)脾氣虛組(飲食失節+勞倦型)：室溫18～23 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進食，適應性飼養1周后開始實驗。先飽食1 d，再禁食2 d，均不禁水，共5個循環；每日水溫35～37 ℃游泳至力竭。(3)脾陽虛組(飲食失節+勞倦+苦寒瀉下型)：每日灌服20%番瀉葉水浸劑(2 ml/100 g)，早晚各1次，連續7 d。觀察大鼠一般體征狀態(體質量、體溫、進食量等)、前肢抓力(肌力檢測)、行為學變化(曠場實驗)對模型進行評價。

1.3.1體質量、體溫、進食量檢測測量3組大鼠體質量、體溫后，放于代謝籠中，計算24 h進食量。

1.3.2肌力檢測采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀進行肌力檢測。先用右手將大鼠按放在抓力板上，左手向前推抓力板，然后右手向后滑至大鼠尾部，左手輕輕松開抓力板，待大鼠用力抓住抓力板時，及時加力后拉，以得到最大前肢抓力。檢測由專人操作，輕拿輕放，避免激怒大鼠，每只大鼠連續測量3次，取平均值。

1.3.3曠場實驗采用TM-Vision行為學實驗系統進行檢測。檢測箱底部分為25個小格，規定中間9格為中心區域，四角的4格為角落區域，其他12個格為周邊區域。實驗時將大鼠放入檢測箱中心，觀察5 min內大鼠在檢測箱內不同區域停留的時間。徹底清潔檢測箱后，檢測下1只大鼠。

1.4RT-PCR法測定GLUT5 mRNA表達水平造模結束后取大鼠近端空腸組織，采用RNAiso Plus試劑盒提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度：A260/A280為1.8～2.2。去除基因組DNA，反轉錄PCR，條件：37 ℃ 15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。利用RT-PCR試劑盒進行擴增反應，條件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 35 s，32個循環。采用7500 RT-PCR儀檢測GLUT5 mRNA表達水平。引物序列：GLUT5基因：上游引物為5′-CTCATCTTCCCGTTCATTC-3′，下游引物為5′-CGTCCGATACCTTGTTCTT-3′；GAPDH基因：上游引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。

1.5Western blotting法測定GLUT5表達水平造模結束后取大鼠近端空腸組織，提取各組大鼠空腸組織總蛋白，采用蛋白定量試劑盒對GLUT5定量分析，取80 μg總蛋白進行二烷基硫酸鈉-聚丙烯乙胺凝膠電泳，電泳完畢后以150 V恒壓30 min半干轉印至PVDF膜，將膜用5%脫脂奶粉常溫下搖床封閉2 h，加入一抗(稀釋比例均為1∶100)，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，15 min/次；加入二抗，常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，化學發光法顯影。

2結果

2.13組大鼠一般體征狀態及前肢抓力比較對照組大鼠動作敏捷，行動靈活，皮毛光澤緊致，大便正常；脾氣虛組大鼠有所消瘦，神疲乏力，部分大鼠行動緩慢，反應略顯遲鈍，被毛蓬起無光澤，便較軟；脾陽虛組大鼠明顯消瘦，神疲倦怠，反應遲鈍，行動緩慢，被毛蓬起無光澤，便軟。3組大鼠體質量、體溫、進食量、前肢抓力比較，差異有統計學意義(P<0.05)。脾氣虛組體質量、進食量、前肢抓力均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；脾陽虛組體質量、體溫、進食量、前肢抓力均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；脾陽虛組體溫低于脾氣虛組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.23組大鼠曠場實驗結果比較3組大鼠中心區域、角落區域、周邊區域停留時間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。脾氣虛組中心區域、周邊區域停留時間長于對照組，角落區域停留時間短于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；脾陽虛組中心區域、角落區域、周邊區域停留時間均短于對照組、脾氣虛組，差異有統計學意義(P<0.05)。對照組、脾氣虛組、脾陽虛組角落區域、周邊區域停留時間均長于中心區域，差異有統計學意義(P<0.05)；脾氣虛組、脾陽虛組周邊區域停留時間長于角落區域，差異有統計學意義(P<0.05，見圖1、表2，本文圖1、2彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.33組大鼠空腸組織GLUT5 mRNA及其蛋白表達水平比較3組大鼠GLUT5 mRNA、GLUT5表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。脾氣虛組、脾陽虛組GLUT5 mRNA、GLUT5表達水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；脾陽虛組GLUT5 mRNA表達水平低于脾氣虛組，差異有統計學意義(P<0.05，見圖2、表3)。

Table 1Comparison of body mass,temperature,food-intake and forelimb grip force among the three groups

組別只數體質量(g)體溫(℃)進食量(g)前肢抓力(g)對照組8314.2±14.437.2±0.523.0±7.11563±208脾氣虛組8180.6±9.4a36.8±0.915.7±3.1a1206±173a脾陽虛組8173.6±19.9a34.4±0.4ab15.0±7.2a1149±180aF值23.927.874.8610.58P值<0.0010.010.04<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05

圖1　3組大鼠曠場實驗運動軌跡

Table 2Comparison of stay time in each area in open field test among the three groups

組別只數中心區域角落區域周邊區域對照組825.06±10.53136.49±38.42c138.50±31.06c脾氣虛組847.25±13.75a88.40±28.30ac164.30±28.33acd脾陽虛組89.21±4.57ab39.57±13.21abc84.63±13.57abcdF值18.3215.4351.84P值<0.0010.002<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05；與同組中心區域比較，cP<0.05；與同組角落區域比較，dP<0.05

注：1、2、3為脾陽虛組，4、5為對照組，6、7、8為脾氣虛組；GLUT5=葡萄糖轉運體5

圖2二烷基硫酸鈉-聚丙烯乙胺凝膠電泳結果

Figure 2Result of SDS-PAGE

表33組大鼠空腸組織GLUT5 mRNA及其蛋白表達水平比較

Table 3Comparison of mRNA and protein expression of GLUT5 among the three groups in jejunum

組別只數GLUT5mRNAGLUT5對照組81.00±0.002.92±0.26脾氣虛組80.67±0.10a1.19±0.14a脾陽虛組80.31±0.11ab1.16±0.06aF值137.4053.97P值<0.001<0.01

注：GLUT5=葡萄糖轉運體5；與對照組比較，aP<0.05；與脾氣虛組比較，bP<0.05

3討論

對脾虛本質的研究一直是中醫基礎研究的重點[6]。長期以來，人們對脾虛模型的研究多集中在神經內分泌、微量元素、免疫、消化、酶學等方面[1]，而在脾虛能量代謝方面的機制研究還未見報道。

本研究脾氣虛模型的建立采用了飲食失節結合勞倦過度的原則，脾陽虛模型則是在脾氣虛的基礎上施加苦寒瀉下法完成[5]。結果顯示，脾氣虛組大鼠消瘦，神疲乏力，行動緩慢，反應略顯遲鈍，被毛蓬起，便較軟；脾陽虛組大鼠明顯消瘦，神疲倦怠，反應遲鈍，被毛無光澤，便軟；脾氣虛組體質量、進食量均低于對照組，脾陽虛組體質量、體溫、進食量均低于對照組，脾陽虛組體溫低于脾氣虛組。說明本實驗飲食失節+勞倦型脾氣虛模型及飲食失節+勞倦+苦寒瀉下型脾陽虛模型制作成功。

“神疲乏力”是評價脾虛模型的重要指征之一，但長期以來，人們對脾虛模型“神疲乏力”的評價手段僅停留在肉眼觀察大鼠狀態的層面上，造成了一定的誤差[7]。本研究創新采用肌力檢測和曠場實驗對“神疲乏力”進行量化評價，以進一步完善脾虛模型客觀化評價方法。前肢肌力檢測可以評價肢體力量，用以判斷神經系統和運動系統的損傷[8]，本研究結果顯示，脾氣虛組、脾陽虛組大鼠前肢抓力低于對照組，其原因可能涉及運動神經系統和前肢肌肉損傷等方面。曠場實驗主要用于觀察嚙齒類動物在新環境中的探索性行為，能夠較為客觀地反映中樞神經系統的興奮性[9]，本研究結果顯示，對照組大鼠角落區域、周邊區域停留時間長于中心區域，反映其好奇程度較高。脾氣虛組大鼠中心區域、周邊區域停留時間長于對照組，角落區域停留時間短于對照組，角落區域、周邊區域停留時間長于中心區域，周邊區域停留時間長于角落區域，說明脾氣虛組大鼠對外界事物關注度降低，好奇程度下降，且反應遲鈍，提示大鼠的中樞結構可能出現損傷，但也不能排除飲食不節所造成的肌肉失養或力竭游泳導致的肌肉損傷。脾陽虛組大鼠中心區域、角落區域、周邊區域停留時間均短于對照組、脾氣虛組，角落區域、周邊區域停留時間長于中心區域，周邊區域停留時間長于角落區域，說明脾陽虛大鼠在脾氣虛基礎上進一步體現畏寒懼冷、喜聚堆懶動的狀態。

葡萄糖是中樞神經系統主要的能源物質，機體所需能量的50%～70%來源于糖[10]。葡萄糖作為營養性碳水化合物主要的消化尾產物，被機體吸收后，能提供能量并為合成其他生命物質提供碳源[11]。GLUTs家族(GLUT1～GLUT5)是細胞葡萄糖轉運的主要載體。目前發現，GLUT5主要分布于成熟的小腸絨毛、基地外側膜、腎近區小管及游動的精子[12]。Honma等[13]研究了連續3 d饑餓大鼠空腸組織GLUT5 mRNA表達水平，發現饑餓大鼠GLUT5 mRNA表達水平明顯下降，對其進行高糖喂食后，空腸組織GLUT5 mRNA表達水平升高，提示GLUT5在哺乳動物空腸單糖吸收過程中起重要作用。Barone等[14]在對GLUT5基因敲除小鼠空腸內果糖吸收量分析后證實，正常飲食小鼠空腸內果糖吸收量降低大約75%，而血清中果糖含量也降低近90%，提示GLUT5基因缺失對小鼠單糖的吸收產生顯著影響。本研究結果顯示，脾氣虛組、脾陽虛組GLUT5 mRNA、GLUT5表達水平低于對照組，脾陽虛組GLUT5 mRNA表達水平低于脾氣虛組，證實脾虛狀態下，GLUT5 mRNA及其蛋白表達水平均有不同程度的降低。

本課題組在模型量化評價上采用肌力檢測和曠場實驗完善了對脾虛狀態下“神疲乏力”的半定量數據分析，但脾虛模型評價仍有很多證型表現有待于進一步探索其量化研究評價體系。本研究目前僅以葡萄糖在體內轉運機制為出發點對脾虛能量代謝本質展開研究，脾虛能量代謝本質實驗復雜，故還需做進一步研究加以驗證。

綜上所述，脾虛狀態下，大鼠空腸組織GLUT5 mRNA及其蛋白表達水平均降低，這可能是脾氣虧虛、能量代謝障礙的重要分子機制之一，其深入研究有待進一步論證。

作者貢獻：尚冰進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；叢培瑋、王艷杰、趙丹玉進行實驗實施、評估、數據整理；馮曉帆、張林進行實驗實施、審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

【關鍵詞】脾氣虛；脾陽虛；空腸；葡萄糖轉運體5型

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Expression of GLUT5 in Jejunum of Model Rats With Spleen-qi Deficiency Syndrome and Spleen-yang Deficiency SyndromeSHANGBing,CONGPei-wei,WANGYan-jie,etal.AcademyofTCM,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveTo build rat models of spleen-qi deficiency syndrome and spleen-yang deficiency syndrome and observe the changes of GLUT5 expression in jejunum of rats,in order to investigate the essence and differences of spleen deficiency syndrome and energy metabolism in different stages.MethodsFrom March to September in 2015,selected 24 male SD rats of SPF grade and divided them into control group,spleen-qi deficiency group and spleen-yang deficiency group,with 8 rats in each group.Models of spleen-qi deficiency were built by the methods of dietary irregularity and overfatigue,and spleen-yang deficiency syndrome models were built by the above methods plus discharge fire withbitter-cold method.General physical signs (body mass,body temperature and food intake),forelimb grip strength (muscle force test) and behavioral changes (open field test) were evaluated.RT-PCR was employed to detect the expression of GLUT5 mRNA,and Western blotting method was used to measure the expression of GLUT5.ResultsSpleen-qi deficiency group was lower than control group in body mass,food intake and forelime grip force (P<0.05);spleen-yang deficiency group was lower than control group in body mass,temperature,food intake and forelimb grip force (P<0.05);spleen-yang deficiency group was lower than spleen-qi deficiency group in temperature (P<0.05).Spleen-qi deficiency group was longer in the stay time in central area and peripheral area and was shorter in the stay time in corner area than control group (P<0.05);spleen-yang deficiency group was shorter than control group and spleen-qi deficiency group in the stay time in central area,corner area and peripheral area (P<0.05).The three groups all had longer stay time in corner area and peripheral area than in central area (P<0.05);spleen-qi deficiency group and spleen-yang deficinecy group had longer stay time in peripheral area than in corner area(P<0.05). Spleen-qi deficiency group and spleen-yang deficiency group were lower than control group in the expression of GLUT5 mRNA and GLUT5 (P<0.05);spleen-yang deficiency group was lower than spleen-qi deficiency group in the expression of GLUT5 mRNA (P<0.05).ConclusionIn the status of spleen deficiency,GLUT5 mRNA and its protein expression of jejunum of rats decreases,which may be one of the most important molecular mechanisms of spleen deficiency and metabolic disorder of energy.

【Key words】Spleen-qi deficiency;Spleen-yang deficiency;Jejunum;Glucose transporter type 5

(收稿日期：2015-08-25；修回日期：2015-12-11)

【中圖分類號】R 256.3

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.019

通信作者：王艷杰，110847 遼寧省沈陽市，遼寧中醫藥大學基礎醫學院；E-mail：15940157054@163.com

基金項目：國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)(2013CB531702)
作者單位：110847 遼寧省沈陽市，遼寧中醫藥大學中醫文獻研究院(尚冰)，教學實驗中心(叢培瑋)，基礎醫學院(王艷杰，趙丹玉，馮曉帆，張林)

·中醫·中西醫結合研究·