腦休眠灌注喚醒實驗研究

葉利斌，花愛遠，代 波，盧婷婷，葉美麟

·論著·

腦休眠灌注喚醒實驗研究

葉利斌，花愛遠，代 波，盧婷婷，葉美麟

【摘要】目的探究兔腦休眠灌注喚醒的機制及其與腦死亡的關系。方法2010年9月—2014年9月選取健康新西蘭白兔36只，按隨機數字表法均分6組(A～F組，各6只)，按可控性兔全腦缺血實驗模型的方法造模，分別比較全腦缺血后的傳統復蘇及全腦缺血后分別用自配的腦保護液、5%葡萄糖溶液及兔血漿等灌注喚醒大腦的效果；利用MS-2000計算機生物信號記錄分析系統全程檢測兔的呼吸、心率、血壓及腦電；目測實驗兔的自主運動、對刺激的反應及腦部水腫等，記錄6組兔的生存率。另選取健康新西蘭白兔6只，分別提取其抗凝血漿及腦、肝、心、腎等組織浸液，用試管法比較腦、肝、心、腎浸液對血液凝固時間的影響(1～5管)。結果A、C、D組兔均不能恢復自主呼吸而死亡；B組兔均反射恢復而生存；E組兔1只不能恢復自主呼吸而死亡，其余5只反射恢復而生存；F組兔3只不能恢復自主呼吸而死亡，其余3只反射恢復而生存。6組兔生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；B、E組兔生存率高于A、C、D組(P<0.003 3)。五管血液凝固時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。2、3、4、5管血液凝固時間長于1管(P<0.05)；3、4、5管血液凝固時間長于2管(P<0.05)；4管血液凝固時間短于3管，5管血液凝固時間長于3管(P<0.05)；5管血液凝固時間長于4管(P<0.05)。結論自主研發的腦保護液可有效防止兔大腦停止供血后迅速發生的腦水腫及血液凝固，使腦休眠期延長達60 min,為臨床進一步研究提供了參考依據。

長期以來均認為，大腦對缺血缺氧敏感，停止供血3～5 min就可出現不可逆死亡。美國的腦死亡實驗室診斷金標準是4條腦血管(頸總動脈和椎動脈)造影無血流灌注和腦電出現平直等[1-4]。然而，最近的研究發現，大腦停止供血、腦電變平直、功能喪失等并非腦死亡，而是腦細胞在停止供血，內環境改變后處于的休眠狀態，當內環境條件恢復后，腦細胞會重新覺醒并執行其功能[5-6]，并在國際上首先提出了腦休眠概念[7]：大腦完全性缺血缺氧后的功能休止狀態稱為腦休眠(cerebral dormancy)，腦休眠開始至能被喚醒的時間稱為休眠期，休眠期后大腦功能不可逆終止稱為腦死亡。本研究通過比較不同灌注液對腦休眠灌注喚醒的效果及腦、肝、心、腎等組織浸液對血液凝固速度的影響，以進一步弄清腦休眠灌注喚醒的機制，找出腦休眠喚醒的有效方法。

1材料與方法

1.1不同灌注液對腦休眠灌注喚醒的效果用自創的可控性兔全腦缺血實驗模型[8]的方法造模，分別比較全腦缺血后的傳統復蘇及全腦缺血后分別用自配的腦保護液、5%葡萄糖溶液及兔血漿等灌注喚醒大腦的效果。

1.1.1實驗材料

1.1.1.1實驗動物2010年9月—2014年9月選取健康新西蘭白兔36只，雌雄不限，體質量3.0～3.5 kg，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.1.2實驗儀器和藥品MS-2000計算機生物信號記錄分析系統，壓力換能器，按釘式引導電極，深動脈血流阻斷套管，三通、四通動脈導管，動物手術器械，照明燈，兔臺，地西泮針劑，1%肝素，兔血漿，5%葡萄糖溶液，腦保護液(自主配方)：100 ml中含氯化鈉0.375 g、乳酸鈉0.077 5 g、氯化鉀0.007 5 g、氯化鈣0.005 g、葡萄糖2.5 g、右旋糖酐(40)7.5 g等。

1.1.2方法

1.1.2.1動物分組及造模將兔按完全隨機數字表法分為A、B、C、D、E、F組共6組，每組6只。A組全腦缺血7.5 min，不做腦部灌注；B組全腦缺血15 min，腦部灌注腦保護液；C組全腦缺血15 min，腦部灌注5%葡萄糖溶液；D組全腦缺血15 min，腦部灌注兔血漿；E組全腦缺血30 min，腦部灌注腦保護液；F組全腦缺血60 min，腦部灌注腦保護液。

本研究創新點：

首先提出了腦休眠的概念，證明大腦可耐受完全性缺血的時間達60 min以上。

論證了腦休眠喚醒的關鍵是有效阻止休眠期腦部迅速發生的腦水腫及血液凝固。

1.1.2.2實驗準備MS-2000計算機生物信號記錄分析系統的準備：將腦電引導電極的輸入線連接上按釘式引導電極，插入一通道插口；將血壓換能器注滿1%肝素后，插入二通道插口。啟動MS-2000系統，進入監視狀態。參數設置：將第一通道輸入選擇“腦電”，增益為1/16 mv/cm；將第二通道輸入選擇“壓力”，增益為1/8檔處；選擇連續示波顯示，掃描基線調到適當位置。

動物手術準備：用地西泮針劑以10 mg/kg的劑量靜脈麻醉后將兔固定在手術臺上。剪去頸部的毛，沿正中線作6～8 cm長的皮膚和皮下組織切口，鈍性分離肌肉，暴露氣管、動脈。

分離兩側椎動脈，套上深動脈血流阻斷套管：用止血鉗于鎖骨水平，沿一側頸總動脈外逐層分離頸筋膜，直至椎前層筋膜。在椎動脈始段搏動明顯處用止血鉗鈍性分離椎前層筋膜，暴露椎動脈，用眼科彎鑷小心在椎動脈下方穿過，并將一根絲線在動脈下方帶出，后用兩根引線把絲線兩端帶過深動脈血流阻斷套管并套牢，以備結扎阻斷椎動脈用。同法分離另一側椎動脈。

分離兩側頸總動脈，連接三通、四通動脈導管：用止血鉗在氣管旁鈍性游離一側頸總動脈，動脈下方穿兩根絲線備用，頸總動脈的兩端(間隔3 cm以上)分別用動脈夾夾閉后于中間剪開兩端，將四通動脈導管(注滿1%肝素)兩端分別插入頸總動脈兩端并用絲線固定。四通動脈導管近頭端的側口接輸液管，近心端的側口接血壓傳感器，開通閥門使血壓傳感器與心端血管相通，打開動脈夾檢測動脈血壓。用同法將三通動脈導管的兩端插入并連接另一側的頸總動脈，側口接輸液管，開通頸總動脈血流。

連接腦電引導電極：在兔頭頂部切開皮膚暴露顱骨，在矢狀縫旁2～3 mm、人字縫前5～6 mm處，用錐鉆刺一小孔，接入按釘式引導電極，參考電極位于皮膚切口，監測腦電活動。

1.1.2.3實驗方法A組利用深動脈血流阻斷套管結扎椎動脈，同時關閉頸總動脈上的閥門，從而阻斷兩側椎動脈和頸總動脈的血流造成兔全腦缺血。B組用和A組相同的方法造成兔全腦缺血后，隨之打開兩側頸總動脈輸液管閥門，讓腦保護液以60滴/min的速度從兩側頸總動脈緩慢注入大腦。C組用和B組相同的方法，并用5%葡萄糖溶液代替腦保護液灌注大腦。D組用和B組相同的方法，并用兔血漿代替腦保護液灌注大腦。E組用和B組相同的方法，且腦保護液灌注的時間從15 min延長至30 min。F組用和B組相同的方法，并將腦保護液灌注的時間從15 min延長至60 min。

1.1.3檢測指標利用MS-2000計算機生物信號記錄分析系統全程檢測兔的呼吸、心率、血壓及腦電；目測實驗兔的自主運動、對刺激的反應及腦部水腫等。記錄6組兔的生存率。

1.2腦、肝、心、腎等組織浸液對血液凝固時間的影響

1.2.1實驗材料

1.2.1.1實驗動物健康新西蘭白兔6只，雌雄不限，平均體質量2.0 kg，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。

1.2.1.2實驗儀器和藥品2 ml試管30支，50 ml燒杯10個，1 ml吸管20支，試管架，地西泮針劑，0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液，1/40 mol/L氯化鈣溶液，0.9% 氯化鈉溶液，秒表，兔臺，乳缽等。

1.2.2方法

1.2.2.1抗凝血漿及腦、肝、心、腎等組織浸液制備兔常規麻醉后行頸部手術，頸動脈放血50 ml進入盛有0.1 mol/L枸櫞酸鈉的燒杯內(一份抗凝劑加9份全血)，搖勻后以1 000 r/min離心10 min(離心半徑13.5 cm)，取上層為枸櫞酸血漿備用。手術取出兔的適量腦、肝、心、腎組織，分別置乳缽中研碎后，以1 g組織加10 ml 0.9% 氯化鈉溶液的比例混勻成組織懸液，分別以1 000 r/min離心8 min(離心半徑13.5 cm)取上清液即為腦浸液、肝浸液、心浸液、腎浸液等備用。

1.2.2.2各管加入成分取2 ml試管5支，標號(1管、2管、3管、4管、5管)后置試管架上，各管均加入同一兔的枸櫞酸血漿0.6 ml，隨后在1管、2管、3管、4管、5管內分別加入該兔的腦浸液、肝浸液、心浸液、腎浸液及0.9% 氯化鈉溶液各0.2 ml并搖勻，在以上五管溶液中同時各加入1/40 mol/L氯化鈣溶液0.2 ml后開始計時，并迅速搖勻，之后每10 s傾斜試管一次，分別記錄各試管血液凝固時間。6只兔均重復上述操作。記錄各管血液凝固時間的均值。

2結果

2.1不同灌注液對腦休眠灌注喚醒的效果

2.1.1A、B、C、D、E、F組實驗結果A組兔均在全腦缺血10～15 s內自主呼吸停止，13～18 s內腦電逐漸消失，1～2 min內血壓反應性增高，隨后血壓迅速下降，呈休克狀態；給予人工胸外按壓搶救，并于阻斷腦血流7.5 min后開通所有被關閉的血管繼續搶救，但均不能恢復自主呼吸而死亡；10 min內對死亡兔進行開顱觀察，發現兔的腦外觀均表現為體積增大膨出，腦膜緊張，表面顏色暗紅，血管模糊，腦回扁平而寬，腦溝變淺及腦室腔變窄等腦水腫及淤血征象。B組兔的呼吸、血壓一直保持平穩，而腦電在阻斷腦血流15～20 s內逐漸消失；15 min后，停止腦保護液灌注，開通兩側頸總動脈和椎動脈血流：兔的血壓、呼吸均繼續保持平穩，腦電活動逐漸恢復，待麻醉作用過后，兔均能爬起行走，反射恢復而生存；2 h后開顱活體觀察，兔的腦外觀正常，供血良好。C組兔在灌注過程中均無法維持呼吸、血壓平穩，只能給予人工胸外按壓維持生命體征；15 min后，停止5%葡萄糖溶液灌注，并開通頸總動脈和椎動脈血流：兔均不能恢復自主呼吸而死亡；開顱觀察兔的腦外觀與A組相同。D組兔在灌注過程中均無法維持呼吸、血壓平穩，只能給予人工胸外按壓維持生命體征；15 min后，停止兔血漿灌注，并開通頸總動脈和椎動脈血流：兔也均不能恢復自主呼吸而死亡；開顱觀察兔的腦外觀與A組相同。E組兔有5只血壓、呼吸一直能自主維持平穩，開通兩側頸總動脈和椎動脈血流后，腦電活動逐漸恢復，待麻醉作用過后，能爬起行走，反射恢復而生存；另1只因不能恢復自主呼吸而死亡；2 h后對存活兔開顱活體觀察，腦外觀正常，供血良好。F組兔3只血壓、呼吸能自主維持平穩，開通兩側頸總動脈和椎動脈血流后，腦電活動也逐漸恢復，待麻醉藥作用過后，能爬起行走，反射恢復而生存；另3只因不能恢復自主呼吸而死亡；2 h后對存活兔開顱活體觀察，腦外觀正常，供血良好。

2.1.2A、B、C、D、E、F組兔生存率比較6組兔生存率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。B、E組兔生存率高于A、C、D組兔生存率，差異有統計學意義(P<0.003 3，見表1)。

表1　A、B、C、D、E、F組生存率的比較〔n(%)〕

注：與A組比較，aP<0.003 3；與B組比較，bP<0.003 3；與C組比較，cP<0.003 3；與D組比較，dP<0.003 3

2.2腦、肝、心、腎浸液對血液凝固時間的影響五管血液凝固時間比較，差異有統計學意義(P<0.05)。2、3、4、5管血液凝固時間長于1管，差異均有統計學意義(P<0.05)。3、4、5管血液凝固時間長于2管，差異均有統計學意義(P<0.05)。4管血液凝固時間短于3管，5管血液凝固時間長于3管，差異均有統計學意義(P<0.05)。5管血液凝固時間長于4管，差異有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2　各管血液凝固時間比較±s，s)

注：與1管比較，aP<0.05；與2管比較，bP<0.05；與3管比較，cP<0.05；與4管比較，dP<0.05

3討論

本研究采用自配的腦保護液，其主要成分是右旋糖酐，其分子量與血漿清蛋白相近，能提高血漿膠體滲透壓，吸收血管外水分；使已經聚集的紅細胞和血小板解聚，降低血液黏滯性；抑制凝血因子Ⅱ的激活，使凝血因子Ⅰ和Ⅷ活性降低及其抗血小板作用均可防止血栓形成[9-10]。該液的晶體滲透壓與血漿相等，不影響細胞膜內外的水分交換，可防止細胞內水腫，而膠體滲透壓高達正常血漿的2倍以上，具有較強阻止組織液生成作用，能有效阻止腦組織缺血缺氧后產生的快速吸水效應，并具有抗凝作用。所以該腦保護液灌注大腦能明顯延長腦休眠期，最長達60 min以上。而C組和D組分別用5% 葡萄糖溶液(無膠體壓)和血漿(膠體壓正常)灌注大腦，因不能有效對抗腦組織缺血缺氧后形成的快速吸水效應，也無抗凝作用，所以這兩組兔均出現腦水腫、腦淤血而死亡。

本研究對全腦缺血再灌注后死亡的兔進行開顱觀察，發現這些兔均很快就出現明顯腦水腫外觀，而全腦缺血不做腦部灌注死亡的兔卻沒有明顯腦水腫表現。說明大腦停止供血后，腦組織出現了特有的快速主動吸水效應，當腦部再灌注時這一吸水效應引起組織液快速生成，迅速發生腦水腫。其結果，一方面使腦部血液濃縮，黏度增高，血流阻力增大，另一方面使腦組織靜水壓增大，腦壓增高，造成腦血管受壓，口徑變小等，加速腦血流淤滯，導致再灌注受阻。同時，本研究在腦、肝、心、腎等組織浸液對血液凝固時間的影響中發現，同樣條件下血液在腦部發生凝固的時間明顯比在肝、心、腎等組織中短，加上腦組織缺血再灌注時的主動吸水效應造成的血液黏度增高、血流淤滯等進一步加快血凝等，這些均可進一步加重腦血流淤堵，形成惡性循環。可見，腦部水腫及血液凝固的發生是全腦缺血再灌注后加快腦死亡的主要原因。然而，腦停止供血后，為什么會形成腦部特有的快速吸水效應？腦部的血液凝固時間為什么比其他部位短？還有待進一步研究。

1985年人們開始做腦缺血再灌注損傷的基礎研究并發現自由基[11]，普遍認為腦再灌注損傷與自由基、鈣超載、興奮性氨基酸、一氧化氮、炎性反應及細胞凋亡等有關[12-17]。用兔進行全腦缺血再灌注的研究報道不多，這些研究報道也多針對以上機制進行[18-22]。本研究是在兔全腦缺血狀態下用腦保護液持續灌注大腦，其方法和手段均是獨特的，實驗結果不支持上述觀點，認為引起腦缺血再灌注損傷的主要原因應該是快速形成的腦水腫、血液凝固等造成的腦血流淤堵。臨床上應用甘露醇[23-24]、疏通血管藥物[25]及抗血小板[26]、抗凝[27]等藥物治療腦缺血性疾病有效也說明了這一問題。能否利用導管介入等手段，將具有高膠體滲透壓及抗血凝作用的藥物直接注入缺血的大腦或缺血灶，以便更有效地用于腦復蘇及腦梗死等缺血性疾病的治療還有待進一步的臨床研究。另外，本研究發現，大腦停止供血后很快出現功能停止、腦電消失，同時腦干功能也受到嚴重影響(呼吸停止，血壓波動大等)，但當灌注腦保護液后腦干功能卻可單獨恢復正常，其原因也有待進一步研究。

腦缺血性疾病是嚴重影響人類生存質量與壽命的疾病，是臨床研究的熱點，缺血可導致腦結構及功能的損害，腦組織損害程度與缺血時間長短及殘存血流量多少相關。短期、不完全性缺血引起可逆性損害，長時間、完全性缺血會引起不可逆損傷。臨床上盡早恢復腦組織血液再灌注，將有效減輕腦缺血損傷。長期以來，人們對腦缺血誘導的再灌注損傷機制的認識眾說紛紜[28-32]，認為過氧化物、細胞內鈣超載、一氧化氮失調控、興奮性氨基酸毒性、蛋白代謝異常、炎性反應及細胞凋亡等與腦缺血再灌注損傷有關，彼此構成一個相互促進的復雜網絡。尤其是完全性腦缺血后導致腦功能停止(腦休眠)，不易用常規方法逆轉，造成全腦缺血后很快死亡的假象，認為大腦對缺氧缺血敏感，停止供血3～5 min就可出現不可逆死亡。然而，本研究證明大腦停止供血后功能喪失、腦電活動停止，只是腦細胞缺血缺氧后表現出的休眠狀態，并非腦死亡，當恢復供血后，腦細胞會被喚醒并重新執行其功能。腦被喚醒的關鍵是恢復腦供血，其關鍵是有效防止腦水腫及血液凝固的發生。并證明腦耐受完全缺血的時間(腦休眠期)達60 min以上。另外，在腦片神經元電活動的記錄實驗中也看到，腦片離體數小時后神經元仍然有活性，說明大腦對缺血缺氧的耐受性很強[33-35]。

綜上所述，腦休眠是大腦停止供血后出現的功能暫時缺失狀態，有效的方法可以逆轉這一狀態。自主研發的腦保護液可有效防止兔大腦停止供血后迅速發生的腦水腫及血液凝固，使腦休眠期延長達60 min，但有必要進一步過度到人體臨床研究得以完善并利用。大腦停止供血后的快速吸水效應及快速血液凝固的深層次原因也有待深入研究，大腦停止供血3～5 min并非發生腦死亡而是處于腦休眠期，腦死亡的標準應重新審視。

作者貢獻：葉利斌對課題總負責與課題實施；花愛遠參與實驗實施與動物模型研究；代波、盧婷婷、葉美麟參與實驗實施。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李婷婷)

【關鍵詞】腦死亡；腦休眠；再灌注；喚醒；腦保護液

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Study of Awakening Rabbit Cerebral Dormancy by PerfusionYELi-bin,HUAAi-yuan,DAIBo,etal.RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanism of awakening rabbit cerebral dormancy by perfusion and its relationship with brain death.MethodsThe study selected 36 healthy New Zealand white rabbits from september 2010 to 2014.Using random number table method,we divided them into 6 groups(group A-F) with 6 rabbits in each group.Controllable whole brain ischemia experiment models were built,and comparison was made among the awakening effects of conventional resuscitation,self-formulated rabbit cerebral protective fluid,5% glucose solution and rabbit plasma.By MS-2000 computer biological signal system,we recorded and analyzed breath,heart rate,blood pressure and electroencephalogram of the rabbits during the whole intervention.Autokinetic movement,response to stimulation and brain edema were observed.The survival rates of the 6 groups were recorded.We selected 6 healthy New Zealand white rabbits and obtained their anticoagulant plasma and tissue extracts of brain,liver,heart and kidney.Using tube method,we compared the influences of brain,liver,heart and kidney extracts on blood coagulation time.ResultsThe rabbits of group A,group C and group D all died because of the irreparability of autonomous respiration;the rabbits of group B all recovered reflection and survived;1 rabbit in group E died because of the irreparability of autonomous respiration,and the rest 5 rabbits recovered reflection and survived;3 rabbits in group F died due to the irreparability of autonomous respiration,and the rest 3 rabbits recovered reflection and survived.The 6 groups were significantly different in survival rate(P<0.05).Group B,group E were higher than group A，group C,group D in survival rate(P<0.05).The five tubes of blood were significantly different in coagulation time (P<0.05).Tube 2,tube 3,tube 4 and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 1(P<0.05);tube 3,tube 4 and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 2 (P<0.05),tube 4 had shorter blood coagulation time than tube 3 (P<0.05),and tube 5 had longer blood coagulation time than tube 3(P<0.05);tube 5 had longer blood coagulation time than tube 4(P<0.05).ConclusionThe self-developed cerebral protective fluid can effectively prevent cerebral edema and blood coagulation that occur rapidly after the halt of cerebral blood supply,with the cerebral dormancy prolonging 60 minutes.The study may provide references for further clinical research.

【Key words】Brain death；Cerebral dormancy；Reperfusion；Waking up；Cerebral protective solution

(收稿日期：2015-06-20；修回日期：2015-10-11)

【中圖分類號】R 331.373

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.014

通信作者：葉利斌，530011廣西南寧市，廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院；E-mail:gxyelibin@sina.com

基金項目：廣西中醫藥大學課題 (P2010092)
作者單位：530011廣西南寧市，廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院(葉利斌，花愛遠，盧婷婷，葉美麟)；廣西中醫藥大學第一附屬醫院(代波)