快速振蕩法高效提取小鼠腹腔巨噬細胞研究

徐尤年，劉桂林，蒙 臣，張詩海

·論著·

快速振蕩法高效提取小鼠腹腔巨噬細胞研究

徐尤年，劉桂林，蒙 臣，張詩海

【摘要】目的通過與傳統的腹腔巨噬細胞提取方法——輕揉法進行比較，建立一種高效提取小鼠腹腔巨噬細胞體外分離培養的方法——快速振蕩法。方法2014年11月選取雄性健康SPF級C57bl/6小鼠20只，采用隨機數字表法分為輕揉組和振蕩組，各10只。分別采用傳統的腹部輕揉法和快速振蕩法提取小鼠腹腔巨噬細胞。流式細胞儀檢測巨噬細胞凋亡率，計算細胞總數及巨噬細胞總數。結果兩組小鼠體質量和腹腔灌洗液回收率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。輕揉組巨噬細胞凋亡率為(5.44±0.08)%，振蕩組巨噬細胞凋亡率為(5.60±0.12)%，差異無統計學意義(t=1.09，P=0.29)。振蕩組細胞總數〔(5.69±0.23)×106與(3.82±0.12)×106〕和巨噬細胞總數〔(2.64±0.08)×106與(1.66±0.07)×106〕均多于輕揉組(P<0.05)。結論快速振蕩法提取小鼠腹腔巨噬細胞，巨噬細胞凋亡率無增加，細胞總數及巨噬細胞總數明顯增加，是一種更加高效的提取腹腔巨噬細胞的方法。

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，體內分布廣泛，在抗感染、抗腫瘤和免疫調節中起著非常重要的作用[1-2]，也是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。與傳代細胞相比，原代細胞與體內組織更接近，形態結構和功能活動更相似[3]，因此備受科研工作者們關注。但如何從這些組織器官中分離、純化獲得高純度、高活性的巨噬細胞，選擇適當的細胞提取方法是體外細胞培養研究工作者的首要任務。本實驗以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，建立一種高效提取小鼠腹腔巨噬細胞體外分離培養的方法——快速振蕩法。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器含3%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)，Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/ 碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(BioLegend公司)，抗小鼠FITC-F4/80流式抗體(BioLegend 公司)，1 ml移液器，5 ml注射器，顯微鏡(Olympus SZ51，日本)，離心機(測維光電TG16A-WS，上海)，流式細胞儀(BD influxTM，美國)。

1.2實驗動物2014年11月選取雄性健康SPF級C57bl/6小鼠20只，8周齡，體質量20～24 g，由武漢大學實驗動物中心提供。

1.3小鼠腹腔巨噬細胞分離、檢測將小鼠摘眼球放血后以頸椎脫臼法處死，采用70%乙醇溶液消毒小鼠腹部皮膚，然后讓其呈仰臥位四肢展開，固定于解剖板上，無菌條件下打開小鼠腹腔，用眼科鑷提起下腹皮膚，剪一小口，并沿腹中線剪開3～5 cm長的腹部皮膚，上至頸部，充分暴露腹膜。取5 ml注射器，向腹腔注射4 ml PBS和1 ml空氣。注意進針勿過深，不要損傷內臟及血管。采用隨機數字表法將小鼠分為兩組。輕揉組10只：采用5 ml注射器吸取腹腔內4 ml的PBS，輕揉腹部2 min，靜置5 min后用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用鑷子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重復灌洗2次。將3次回收的腹腔灌洗液置于離心管。振蕩組10只：用5 ml注射器吸取4 ml PBS和1 ml空氣注入腹腔，右手拿起解剖板，快速水平振蕩2 min(約100次)，用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。然后用鑷子提起腹膜，在腹膜上剪一小口，再用1 ml移液器取PBS 1 ml重復灌洗2次。將3次回收的腹腔灌洗液置于離心管。計算腹腔灌洗液回收率：記錄每只小鼠3次腹腔灌洗液的總體積，除以總量3 ml。

本研究創新點：

作為一種免疫細胞，巨噬細胞在病原微生物清除、炎性反應、腫瘤發生發展中扮演重要角色，也是研究細胞免疫和分子免疫學的重要對象。但如何提取高純度的原代巨噬細胞進行科學實驗是困擾研究者們的一個難題，輕揉法是提取原代巨噬細胞最常用的方法。根據巨噬細胞易黏附、貼壁的特點，本研究提出振蕩法這一新的提取巨噬細胞的方法，跟傳統的輕揉法進行對比發現，振蕩法可以獲取更多的巨噬細胞，從而為科研工作者獲取原代巨噬細胞提供新的方法。

1.4細胞凋亡分析參照流式細胞儀試劑盒操作規范，4 ℃，300×g離心5 min，收集5×105個細胞，重懸細胞后，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，避光、室溫反應10 min。樣品在1 h內采用流式細胞儀檢測巨噬細胞凋亡率。

1.5細胞計數4 ℃，400×g離心6 min，所得細胞沉淀用PBS重懸，充分混勻后用血球計數板計數并計算細胞總數。

1.6巨噬細胞分類計數參照本課題組前期的方法[4]進行巨噬細胞流式標記檢測。腹腔灌洗細胞(1×106個) 懸液100 μl中，加入抗小鼠 FITC-F4/80抗體0.5 μl，室溫避光作用 40 min，用2 ml PBS 混勻，400×g離心5 min，棄去上清液，加入200 μl PBS，采用流式細胞儀測定細胞總數和巨噬細胞總數。

2結果

2.1兩組小鼠體質量和腹腔灌洗液回收率比較兩組小鼠體質量和腹腔灌洗液回收率比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。

Table 1Comparison of body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids between the two groups

組別只數體質量(g)灌洗液回收率(%)輕揉組1022.1±0.582.89±1.13振蕩組1022.5±0.583.19±0.96t值0.130.20P值0.930.64

2.2兩組巨噬細胞凋亡率比較輕揉組巨噬細胞凋亡率為(5.44±0.08)%，振蕩組巨噬細胞凋亡率為(5.60±0.12)%，差異無統計學意義(t=1.09，P=0.29，見圖1)。

2.3兩組細胞總數和巨噬細胞總數比較輕揉組細胞總數為(3.82±0.12)×106，振蕩組細胞總數為(5.69±0.23)×106，差異有統計學意義(t=7.39，P<0.001)。輕揉組巨噬細胞總數為(1.66±0.07)×106，振蕩組巨噬細胞總數為(2.64±0.08)×106，差異有統計學意義(t=9.56，P<0.001，見圖2)。

3討論

本課題組在提取腹腔巨噬細胞時發現，巨噬細胞貼壁性很強，參照傳統的輕揉法[5-6]提取的腹腔細胞數量少，巨噬細胞比例低，并且需要靜置5～7 min，甚至更長時間。本課題組經過反復實驗，對傳統方法進行了改進，提出快速振蕩法，提高了巨噬細胞的提取率，提取的巨噬細胞活力與傳統的方法相似，縮短了實驗時間，方便了實驗的進行。

注：FITC=異硫氰酸熒光素，PI=碘化丙啶

圖1Annexin V-FITC/PI流式細胞儀檢測巨噬細胞凋亡率

Figure 1Apoptosis rate of macrophages apoptosis detected by Annexin V-FITC/PI FCM

圖2　兩組小鼠分離細胞

目前，腹腔巨噬細胞可以直接提取，也可以先在腹腔注入巨噬細胞刺激劑(如肉湯、淀粉、蛋白胨等)[7-8]，誘導巨噬細胞進入腹腔，從而提高巨噬細胞的獲取數量。雖然此法能收集到大量的腹腔巨噬細胞，但獲得的腹腔巨噬細胞與原體內巨噬細胞相比，功能基礎已經發生了一定程度的變化，因此與這種方法相比，直接提取方法避免了注入的大分子物質對巨噬細胞功能的影響[6，9]。傳統的直接提取巨噬細胞的方法就是輕揉法[6，10]。

本研究根據巨噬細胞特點提出快速振蕩法，與傳統的輕揉法相比，快速振蕩法提取的腹腔細胞總數和巨噬細胞總數更多。其原因可能是：(1)輕揉法局部刺激了腸道，增加了成纖維細胞和淋巴細胞的比例。(2)快速振蕩法增大了對腹腔內細胞的沖刷作用，促使巨噬細胞游離，因此可以獲取更多的巨噬細胞。(3)在應用快速振蕩法時腹腔內有1 ml的空氣，增加了液體移動空間，同時減少了腹腔灌洗液的外滲和細胞的丟失，有利于提高液體回收率和細胞數。本實驗中，快速振蕩法與輕揉法比較，腹腔灌洗液回收率無差異，因為輕揉法提取腹腔巨噬細胞的動作輕柔，腹腔灌洗液回收率已經比較高，腹腔灌洗后部分液體滯留在腹腔臟器間隙，難以完全回收?？焖僬袷幏ㄖ?，1 ml空氣對快速振蕩法的成功使用至關重要，如果未注入1 ml空氣，快速振蕩時壓力的快速變化會導致腹腔灌洗液的外滲，降低腹腔灌洗液回收率和細胞數。同時本研究發現，兩組巨噬細胞凋亡率相似，說明快速振蕩法并未對提取細胞的存活產生影響。

快速振蕩法提取腹腔巨噬細胞的過程中，需要特別注意幾點：(1)頸椎脫臼法處死小鼠之前先摘眼球放血，減少提取的細胞中紅細胞的比例，減少紅細胞對巨噬細胞的刺激活化，有利于巨噬細胞基礎功能的保持和后續實驗研究。(2)腹腔灌洗時用4 ml PBS和1 ml空氣注入腹腔，空氣進入腹腔后在最上面，減少振蕩過程中腹腔內的液體從注射針孔外溢，提高腹腔灌洗液回收率和細胞數。(3)用注射器或者是槍頭在腹腔吸取腹腔灌洗液時避免對腹腔內臟器的過度刺激(不要將大小腸吸入移液器槍頭)，減少腹腔灌洗液中的成纖維細胞(成纖維細胞也是貼壁細胞，后續實驗中貼壁洗滌純化得到巨噬細胞時無法將成纖維細胞去除，只能去除淋巴細胞和紅細胞)。(4)灌洗液中加入3%胎牛血清，或者是直接用RPMI 1640培養基灌洗，一方面可以提高巨噬細胞的提取數量，另一方面可提供營養物質，維持細胞活性。

針對巨噬細胞貼壁性強的特點，本課題組通過反復實驗對巨噬細胞提取方法進行改進，提出快速振蕩法。該方法簡單易行，縮短了實驗時間(輕揉法要求按摩腹部5 min甚至更長，導致腹腔臟器水腫，腹腔灌洗液回收率低)，極大提高了腹腔巨噬細胞的獲取率，方便了科研工作者對巨噬細胞功能的研究。

作者貢獻：徐尤年設計、收集、分析數據撰寫完成，并對文章負責；劉桂林、蒙臣輔助；張詩海指導并負責實驗質量控制和文章審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1] Lin WM,Dai AL,Yin HF,et al.Culture and functional identification of macrophages from human peripheral blood [J].Chinese Journal of Immuology，2015,31(1):86-89.(in Chinese)

林煒明，戴愛玲，尹會方，等.人外周血巨噬細胞培養及功能鑒定[J].中國免疫學雜志，2015,31(1):86-89.

[2] Zhao Y,Zhao Y.Differenciation character and molecular regulation of mono-neuclear phagocyte cystem[J].Chinese Journal of Immuology，2014,30(1):126-132.(in Chinese)

趙陽，趙勇.單核-巨噬細胞起源及發育分化的特征與分子調控[J].中國免疫學雜志，2014,30(1):126-132.

[3] Yan YL,Liu Y,Bu XF,et al.Isolation and purification and primary culture of lung cells from rats[J].Journal of Jiangsu University(Medicine Edition) 2008,18(1):11-14.(in Chinese)

嚴玉蘭，劉洋，步雪峰，等.鼠肺細胞的分離純化及原代培養[J].江蘇大學學報：醫學版，2008,18(1):11-14.

[4] Xu Y,Zhang Z,Ma P,et al.Adenovirus-delivered angiopoietin 1 accelerates the resolution of inflammation of acute endotoxic lung injury in mice[J].Anesth Analg,2011，112(6):1403-1410.

[5] Zhang SL,Li SF.Separation,cultivation and identification of mouse peritoneal macrophages[J].Hainan Medical Journal，2014,25(19):2814-2815.(in Chinese)

張淑莉，李素芬.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養與鑒定[J].海南醫學，2014，25(19):2814-2815.

[6] Yin MZ,Li SP,Yuan L,et al.Separation,cultivation and identification of mouse peritoneal macrophages[J].Medical Journal of Wuhan University，2006,27(2):203-205.(in Chinese)

尹美珍，李世普，袁琳，等.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養與鑒定[J].武漢大學學報:醫學版，2006,27(2):203-205.

[7] Meng C,Liu G,Mu H,et al.Amphiregulin may be a new biomarker of classically activated macrophages[J].Biochem Biophys Res Commun，2015,466(3):393-399.

[8] Gao P,Shi L,Zhang RL.Extraction and identification of peritoneal macrophages from mice[J].Chinese Journal of Medical Laboratory Technology，2004,5(5):400-402.(in Chinese)

高鵬，石磊，張潤玲.小鼠腹腔巨噬細胞的提取與鑒別方法探討[J].中國醫學檢驗雜志，2004,5(5):400-402.

[9] Li HT,Xiao D,Qu XM,et al.Separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages[J].Progress in Modern Biomedicine，2008,8(4):638-639.(in Chinese)

李海濤，肖丹，屈學民，等.小鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養[J].現代生物醫學進展,2008,8(4):638-639.

[10] Luo YK,Cheng Y.Separation and cultivation of mouse peritoneal macrophages[J].Guide of Sci-tech Magazine，2013,10(14):15-23.(in Chinese)

羅亞坤，程燕.小鼠腹腔巨噬細胞的分離培養與鑒定[J].科技致富向導，2013,10(14):15-23.

(本文編輯：陳素芳)

【關鍵詞】巨噬細胞；小鼠；細胞分離

徐尤年，劉桂林，蒙臣，等.快速振蕩法高效提取小鼠腹腔巨噬細胞研究[J].中國全科醫學，2016，19(3)：303-306.[www.chinagp.net]

Xu YN,Liu GL,Meng C,et al.Highly effective extraction of mouse peritoneal macrophages by quick vibrating method[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：303-306.

Highly Effective Extraction of Mouse Peritoneal Macrophages by Quick Vibrating MethodXUYou-nian,LIUGui-lin,MENGChen,etal.DepartmentofAnesthesiology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430032,China

【Abstract】ObjectiveTo establish a high-efficiency method to obtain mouse peritoneal macrophages for separation and cultivation in vitro,which is quick vibrating method,by comparison with the traditional method,which is soft kneading method.MethodsIn November 2014,20 male healthy C57bl/6 rats of SPF grade were collected,and random number table method was employed to divide the rats into soft kneading group and rapid oscillation group,with 10 rats in each group.Traditional abdomen soft kneading method and quick vibrating method were employed to extract mouse peritoneal macrophages.FCM was used to detect the apoptosis rate of peritoneal macrophages,and the total number of cells and peritoneal macrophages were calculated.ResultsThe two groups were not significantly different in the body mass and the recovery rate of peritoneal lavage fluids (P>0.05).The apoptosis rate of peritoneal macrophages of soft kneading group was (5.44±0.08)%,and that of rapid oscillation group was (5.60±0.12)%,without significant differences between the two groups.The rapid oscillation group was higher than the soft kneading group in the total number of cells〔(5.69±0.23)×106vs.(3.82±0.12)×106〕 and peritoneal macrophages 〔(2.64±0.08)×106vs.(1.66±0.07)×106〕 (P<0.05).ConclusionThe extraction of peritoneal macrophages by the quick vibrating method cause no increase of the apoptosis rate of peritoneal macrophages and marked increase of the total number of cells and peritoneal macrophages.Therefore,it is a more effective method of peritoneal macrophages extraction.

【Key words】Macrophages；Mice；Cell separation

(收稿日期：2015-08-11；修回日期：2015-12-09)

【中圖分類號】R 446.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.013

通信作者：徐尤年，430032 湖北省武漢市，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院麻醉科；E-mail：xyn0103@126.com

基金項目：國家自然科學基金青年基金資助項目(81201454)
作者單位：430032 湖北省武漢市，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院麻醉科