HPLC法測定桃核承氣湯中10種成分的含量

陳淮臣，何 利，石 亞，劉 文

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004)

桃核承氣湯(THCQD)出自《傷寒論》，由桃仁、大黃、桂枝、甘草、芒硝組成[1]，是《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》所載的第一個方劑[2]。該方具有逐瘀瀉熱之功效，主治下焦蓄血證，對糖尿病、胰腺炎、婦科炎癥等多種疾病具有一定治療作用[3-5]。其研究目前主要集中在臨床報道和藥理藥效[6-8]，質(zhì)量方面的研究較少。本研究首先基于古籍記載制備桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)[9]，然后采用HPLC建立其中10種成分的含量測定方法，用以評價桃核承氣湯的質(zhì)量，為桃核承氣湯現(xiàn)代制劑的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 II型高效液相色譜儀、DAD型紫外-可見檢測器(美國安捷倫公司)；BPZIID型電子分析天平(德國Satrorius公司)；科導(dǎo)SK8210HP型臺式超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜純，TEDIA)，磷酸(色譜純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 對照品

沒食子酸(批號：180213)、芹糖異甘草苷(批號：181216)、甘草酸(批號：181025)、兒茶素(批號：181209)、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷(批號：190409)、大黃酚-8-O-葡萄糖苷(批號：190118)、大黃素-8-O-葡萄糖苷(批號：190118)、番瀉苷A(批號：181219)對照品購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。大黃酸(批號：110757-201607)、肉桂酸(批號：110786-201604)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 藥材

5種飲片購自昆明菊花村藥材市場，桃仁產(chǎn)地為河北，大黃產(chǎn)地為青海，桂枝產(chǎn)地為廣西，甘草產(chǎn)地為新疆，芒硝產(chǎn)地為西藏，每種飲片3個批次，經(jīng)鑒定各藥材均符合2015年版《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定。

2 溶液制備

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸對照品適量，加甲醇制成濃度分別為10.40、30.27、55.33、15.54、8.27、6.67、8.27、3.36、4.19、59.97 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉

按《傷寒論》中桃核承氣湯原方記載并結(jié)合文獻進行多方面的循古考證[10]，其中桃仁(去皮尖)采用燀桃仁；桂枝(去皮)采用桂枝；甘草(炙)采用炒甘草，以1兩等于13.8 g計，稱取飲片，加純凈水1 400 mL，武火煮沸，文火微沸至500 mL，200目紗布雙層過濾，減壓濃縮，55 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，制得桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)(S1～S5)。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉0.1 g，置于25 mL具塞錐形瓶瓶中，加 70%甲醇超聲45 min(功率500 W，頻率50 kHz)使溶解并定容至刻度，搖勻后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，以續(xù)濾液作為供試品溶液。

3 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相0.2%磷酸水(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0～10 min，25%B；10～15 min，25%～34%B，15～20 min，34%B；20～22 min，34%～40% B；22～37 min，40%～48% B；37～40 min，48%～54% B；40～48 min，54% B；48～55 min，54%～63% B；55～60 min，63%～69% B；60～70 min，69%～75% B；70～72 min，75%～100%B；檢測波長：254 nm；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

注：1.沒食子酸；2.兒茶素；3.大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷；4.芹糖異甘草苷；5.番瀉苷A；6.肉桂酸；7.大黃酚-8-O-葡萄糖苷；8.大黃素-8-O-葡萄糖苷 9.大黃酸 10.甘草酸

圖1 桃核承氣湯(A)、混合對照品(B)樣品HPLC色譜

4 方法學(xué)考察

4.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取不同體積的混合對照品溶液適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備不同濃度的混合對照品溶液，按“3”項下色譜條件進行測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，用最小二乘法進行線性回歸，以計算線性方差和相關(guān)系數(shù)r，見表1。結(jié)果表明，10個成分在一定濃度范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系。

表1 桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)10種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

4.2 精密度試驗

取桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉(S1)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得到?jīng)]食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

4.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“3”項下色譜條件分別于0，2，4，6，12，24 h 進行測定，計算得到?jīng)]食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸峰面積的RSD均小于2.0%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.4 重復(fù)性試驗

取同一批桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉(S1)，同“2.3”項下方法平行制備 6 份供試品溶液，按“3”項下色譜條件進行測定，計算得到?jīng)]食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸峰面積的RSD均小于2.0%，表明本方法重復(fù)性良好。

4.5 加樣回收試驗

精密稱定6份同一批桃核承氣湯供試品(S1)0.05 g，分別置入25 mL容量瓶中，分別加入各對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“3”項下色譜條件依次測定，計算得到?jīng)]食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸的平均加樣回收率分別為98.88%、98.11%、98.99%、97.85%、99.07%、101.52%、99.92%、97.44%、98.98%、99.51%；RSD分別為0.21%、2.31%、0.46%、0.68%、0.75%、1.88%、0.37%、0.31%、0.44%、0.39%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

5 樣品測定

按“2.2”項下方法使用3個批次藥材分別制備3批桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉(S1～S3)，按“2.3”項下方法將每批次物質(zhì)基準(zhǔn)浸膏粉各平行制備3個供試品溶液，按“3”項下色譜條件依次測定，求平均值，結(jié)果見表2。

表2 3批桃核承氣湯中10種成分含量測定平均值 (mg/g，n=3)

6 結(jié)果與討論

本研究采用高效液相色譜法，同時測定了桃核承氣湯中沒食子酸、兒茶素、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、芹糖異甘草苷、番瀉苷A、肉桂酸、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸、甘草酸10種成分的含量，該方法有效、便捷，能夠反映桃核承氣湯的化學(xué)成分特征。