rpoB基因不同突變位點結核分枝桿菌利福平體外最小抑菌濃度的變化▲

萬智敏向延根 馬小華 石國民 范任華 彭雪峰

(1 南華大學臨床醫學院，衡陽市 421001，E-mail：304069315@qq.com；2 長沙市中心醫院檢驗科，長沙市 410004)

論著·臨床研究

rpoB基因不同突變位點結核分枝桿菌利福平體外最小抑菌濃度的變化▲

萬智敏1，2向延根2馬小華2石國民2范任華2彭雪峰2

(1 南華大學臨床醫學院，衡陽市 421001，E-mail：304069315@qq.com；2 長沙市中心醫院檢驗科，長沙市 410004)

目的 探討rpoB基因不同突變位點結核分枝桿菌利福平體外最小抑菌濃度(MIC)的變化。方法 收集人型的結核分枝桿菌菌株103株，利用基因芯片法篩選rpoB耐藥突變基因菌株。采用絕對濃度法對所有菌株進行不同濃度的利福平藥敏試驗，觀察不同菌株對利福平的MIC。結果 基因芯片共分離出55株rpoB突變株，48株非突變株。突變株MIC值為 (459.6±205.8)μg/ml，高于非突變株的(5.0±4.5)μg/ml(P<0.05)。55株rpoB突變株中突變位點分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)，531(C→T)位點突變株的MIC值為(576.0±29.3)μg/ml，均高于516(A→G/T)的(432.9±38.2)μg/ml和526(C→G/T)的(355.5±59.5)μg/ml(P<0.05)，但526(C→G/T)、516(A→G/T)位點突變株的MIC比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 基因芯片檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變株與其耐藥表型相關性較高。不同突變位點的結核桿分枝菌菌株對利福平的耐藥程度有差異，可為臨床合理用藥提供參考。

結核分枝桿菌；rpoB基因；芯片基因；利福平；最小抑菌濃度

我國是結核病高負擔國家，也是耐藥結核高負擔國家[1]。利福平作為一線抗結核藥物，由于各種原因導致結核分枝桿菌對其產生耐藥。基因芯片法是檢測結核分枝桿菌耐藥基因的新方法，對利福平耐藥基因的檢測與表型檢測符合率在95.0%以上[2]。但是目前臨床上對結核分枝桿菌利福平耐藥性的研究多局限于定性檢測，尚未對耐藥基因相應位點的突變引起的耐藥水平進行深入研究。本研究通過分析基因芯片分離出的rpoB突變株利福平耐藥的情況，探討rpoB基因不同突變位點對其利福平最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的影響，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集長沙市中心醫院2014年1月1日至2015年9月30日臨床送檢的肺結核患者痰標本，按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[3]處理痰標本獲得菌懸液，經在BACTEC MGIT-960結核桿菌培養儀(美國BD公司)，用Middlebrook 7H9液體培養基(碧迪醫療器械上海有限公司，批號：5260715)培養，涂片鑒定為結核分枝桿菌陽性的菌株共103株，經PNB和TCH培養基鑒定均為人型結核分枝桿菌，且PNB敏感、TCH耐藥。H37Rv標準菌株由中國結核病控制中心參比實驗室提供。

1.2 主要儀器、設備和試劑 利福平純藥粉由美國Sigma公司提供(批號：Lot080M1506V)；結核分枝桿菌耐利福平芯片檢測配套設備包括Extractor 36核酸快速提取儀、BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、SlideWasherTM8芯片洗干儀和LuScan 10K-B微陣列芯片掃描儀均為北京奧博生物有限公司生產；HB-100干式恒溫金屬浴(上海之信儀器有限公司)；PCR擴增儀7300(美國ABI有限公司)；H1650-W高速臺式離心機(湖南湘儀有限公司)；FX-1200-B2生物安全柜(上海瑞仰凈化裝備有限公司)；DW-86L-388A低溫冰箱(中國海爾有限公司)；自制改良羅氏培養基按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[3]進行配置。谷氨酸鈉(加加集團有限公司，批號：GB/T8967)；磷酸二氫鉀(光華有限公司，批號：20110928)；硫酸鎂(批號：20110322)和枸櫞酸鎂(批號：20110627)為光復精細化工研究所生產；孔雀綠(批號：20110110)和吐溫80(批號：20130927)均為科密歐化學試劑有限公司生產。

1.3 基因芯片法篩選耐藥基因突變菌株

1.3.1 DNA提取：從Middlebrook 7H9液體培養基中吸取約1個麥氏單位濁度的人型結核分枝桿菌菌懸液20 μl于核酸提取管中，加入80 μl的核酸提取液試劑，用Extractor 36核酸快速提取儀震蕩10 min，100℃金屬浴5 min，12 000 r/min離心1 min，得到的核酸提取液放置于-20℃保存待檢。

1.3.2 PCR擴增：取出PCR擴增試劑(北京奧博生物有限公司，批號：0112151601)自然解凍，瞬時離心至管底。每個菌株的核酸提取液標本進行3管反應，將擴增液1、2、3分別按每管18 μl分裝，對于一個樣本，向3管中分別加入同一樣本DNA各2 μl，放入ABI7300PCR擴增儀中擴增。擴增條件設定為：37℃ 600 s；94℃ 600 s；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環；94℃ 30 s，72℃ 60 s，共10個循環；72℃ 420 s。

1.3.3 耐藥基因檢測：將擴增好的產物置于7300 PCR擴增儀中95℃變性5 min，冰浴5 min，取出雜交緩沖液按9 μl雜交緩沖液、3 μl+3 μl PCR產物的比例配制雜交混合液，吸取13.5 μl混合液加入雜交芯片加樣孔中，置入已設置雜交條件為50℃、2 h的BioMixerTMⅡ芯片雜交儀中進行雜交。雜交完成后，再進行芯片洗滌、干燥、芯片掃描及結果判讀。以試劑盒自帶的陰陽性對照作為質控，利福平相關rpoB基因探針分布見表1。

表1 利福平rpoB基因相應位點基因突變的類型

注：QC：表面化學質控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內對照探針；WT：野生型。

1.4 羅氏培養基的制備及菌株的菌種復蘇

1.4.1 改良羅氏培養基制備：按改良羅氏培養基配方稱取谷氨酸鈉28.8 g，磷酸二氫鉀9.6 g，硫酸鎂0.9 g、枸櫞酸鎂2.4 g，加2 400 ml水溶解后，加甘油48 ml、孔雀綠溶液80 ml，加入全卵液4 000 ml，充分混勻后倒入容量為10 ml的塑料杯子約7 ml，高壓蒸汽滅菌備用。另配置10個不同利福平濃度的羅氏培養基，分別為5.0 μg/ml、10.0 μg/ml、20.0 μg/ml、40.0 μg/ml、80.0 μg/ml、160.0 μg/ml、320.0 μg/ml、640.0 μg/ml、1 280.0 μg/ml、2 560.0 μg/ml；羅氏培養基的利福平藥物臨界濃度為40.0 μg/ml。1.4.2 菌株的菌種復蘇：對所有篩選的菌株標本進行菌種復蘇，從Middlebrook 7H9液體培養基中取1ml的菌懸液加到改良羅氏培養基上，36℃溫箱，培養1個月左右，待斜面長出菜花樣的菌落。

1.5 菌株的藥敏實驗

1.5.1 菌液制備和菌種接種：按《結核病診斷細菌學檢驗規程》[3]進行微生物敏感性試驗。在磨菌管中加入少量玻璃珠(8～10顆)、0.1 ml吐溫80試劑、1 ml無菌生理鹽水，用無菌接種環刮取改良羅氏培養基斜面上的分枝桿菌菌落數個，加入磨菌管內，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器震蕩將分枝桿菌磨散，靜置30 min；吸取菌液(避免吸取底部較大的顆粒)轉移至無菌試管內，加入5ml無菌生理鹽水培養液調制菌液濃度至0.5個麥氏濃度，再將0.5個麥氏濃度的菌懸液按1 ∶20倍稀釋；用1 ml注射器吸取0.1 ml已稀釋標本加入到不同濃度利福平羅氏培養基中，放入34℃溫箱進行培養；1個月后觀察培養基上耐藥菌株的生長情況，并進行結果分析。

1.5.2 結果判讀：嚴格按《結核病診斷實驗室檢驗規程》[3]判讀結果。敏感：培養基斜面上無菌落生長；耐藥：菌落數占藥敏培養基斜面面積1/4以上；當菌落數<20個時，報告實際的菌落數；無藥對照管菌落數<50，需重新進行藥敏試驗。

1.6 質量保證 每批藥敏試驗均由經驗豐富的人員操作，從培養基的配制到藥敏試驗、結果的報告均嚴格執行無菌操作規程，并用H37Rv標準株作為質控。

1.7 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，Levene檢驗方差齊性，方差不齊采用Dunnett檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 rpoB基因芯片篩選結果 根據實驗需要，本次檢測到的rpoB突變類型分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)，本次檢測的所有位點及ropB野生型基因芯片的檢測結果見圖1。

圖1 不同rpoB突變位點基因芯片圖

2.2 突變株與非突變株MIC比較 本次檢測的rpoB突變類型分別為531(C→T)、526(C→G/T)和516(A→G/T)。103株標本中，基因芯片檢測出55株為突變株，48株為非突變株。突變株MIC值為 (459.6±205.8)μg/ml，高于非突變株的(5.0±4.5)μg/ml(t=16.377，P<0.001)。2.3 不同突變類型MIC分布 突變菌株不同突變類型的MIC值比較，差異有統計學意義(P<0.05)。531(C→T)突變株MIC高于526(C→G/T)、516(A→G/T)，差異均有統計學意義(P<0.05)，而526(C→G/T)突變株MIC和516(A→G/T)突變株MIC比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 突變菌株不同突變類型的MIC值比較(x±s，μg/ml)

注：與531(C→T)比較，*P<0.05。

3 討 論

利福平是結核病的治療方案中必不可少的一線藥物之一，其主要作用機制是通過結合RNA聚合酶β亞基，使RNA聚合能力受到抑制，從而終止RNA的合成[4-5]。利福平耐藥性主要是由集中在密碼子507～533位堿基區域發生突變導致，這些區域稱耐藥決定區[6]。研究發現利福平治療失敗更容易引發耐多藥結核[7]。但是臨床上采用絕對濃度法界定利福平耐藥臨界值為40.0 μg/ml以判讀耐藥或敏感，并未根據耐藥菌株對利福平耐藥程度進行深入研究。因此，有必要對基因芯片法檢測的rpoB基因突變株進行耐藥表型MIC檢測，以了解rpoB基因不同突變類型與利福平耐藥表型之間的關系。

基因芯片法具有簡單、快速等特點，逐漸被大多數結核病?？漆t院所采用，對rpoB突變的檢測結果與RFP表型耐藥的符合度達95.0%左右[8-9]。利福平耐藥相關基因rpoB基因包括6個位點13種突變類型，包括531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC及533位CTG→CCG等[10]。本次研究采用基因芯片技術篩查了55例ropB突變型，基因突變類型分別為531位TCG→TTG、526位CCC→CGC和CCC→CTC和516位GAC→GTC及GAC→GGC。55株突變菌株MIC值為(459.6±205.8)μg/ml，而非突變株MIC值均在40.0 μg/ml以下，突變株總的MIC值明顯高于非突變株(P<0.05)，這說明結核分枝桿菌對利福平耐藥的根本原因是rpoB基因相應位點產生突變，耐藥主要是由耐藥基因引起。本次研究的531位點突變株MIC值顯著高于516位點和526位點突變株(P<0.05)，這提示具有不同突變位點的菌株對利福平的耐藥性存在差異，在臨床上可以為耐多藥的患者在無藥可用的情況下提供用藥參考。此外，本次研究中，516和526位點突變株MIC值比較，差異無統計學意義(P>0.05)，這與文獻報告的526位點引起高水平耐藥而516位點引起低水平耐藥有差異[11]。總之，rpoB基因不同的突變模式對利福平產生的耐藥程度有顯著的差異，可以為臨床用藥提供參考，特別是全耐藥病人患者，可以根據不同的突變模式選擇不同藥物的MIC值來用藥，但體內用藥還需進一步臨床試驗驗證[12]。

本研究尚存在不足之處：(1)本次試驗選擇的突變株例數偏少，可能所測MIC值存在偏差，下一步將擴大樣本量進行研究；(2)本次分離的突變位點是本院主要的突變位點，尚未涉及到其他突變類型，下一步在擴大樣本量的同時盡可能找出其他突變類型進行研究。此外，同一突變位點不同堿基之間的耐藥情況是否存在差異尚待研究。(3)本次試驗選取的標本時間跨度大，位于低溫長時間保存的菌株可能會產生一定的變異抑或已經死亡導致未復蘇成功。

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Changes in minimal inhibitory concentration of rifampicin in vitro for mycobacterium tuberculosis strains with different rpoB gene mutation

WANZhi-min1,2,XIANGYan-gen2,MAXiao-hua2,SHIGuo-ming2,FANRen-hua2,PENGXue-feng2

(1ClinicalMedicalCollege,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2DepartmentofClinicalLaboratory,ChangshaCentralHospital,Changsha410004,China)

Objective To explore the changes in minimal inhibitory concentration(MIC) of rifampicin in vitro for mycobacterium tuberculosis strains with different rpoB gene mutation.Methods A total of 103 strains of human mycobacterium tuberculosis were collected,and the strains with drug-resistant mutant gene rpoB were screened using gene chip technology.The drug sensitivity test with different concentrations of rifampicin was conducted in all strains by absolute concentration method.Then the MICs of rifampicin for different strains were observed.Results Fifty-five strains with rpoB gene mutation and 48 without rpoB gene mutation were isolated by gene chip technology.The MIC of mutant strains was (459.6±205.8)μg/ml,and was higher than that of non-mutant strains[(5.0±4.5)μg/ml,P<0.05].The mutation sites of mutant strains included 531(C→T),526(C→G/T) and 516(A→G/T).The MIC of the strains with mutation site of 531(C→T)was (576.0±29.3)μg/ml,and was higher than that of the strains with 516(A→G/T)[(432.9±38.2)μg/ml] or 526(C→G/T)[(355.5±59.5)μg/ml,P<0.05].But there was no significant difference in the MIC between the mutation strains with 516(A→G/T) and 526(C→G/T)(P>0.05).Conclusion The mutation of rpoB gene identified by gene chip is closely related to the phenotype of drug resistance.Difference in severity of drug resistance for rifampicin is found among the strains of mycobacterium tuberculosis with different mutation sites,which can provide the references for clinical rational drug use. 【Key words】 Mycobacterium tuberculosis,rpoB gene,Gene chip,Rifampicin,Minimum inhibitory concentration

國家十二五重大專項課題(2013ZX10005004-004)

萬智敏(1989～)，女，本科，檢驗技師，研究方向：臨床微生物學。

向延根(1963～)，男，碩士，主任技師，研究方向：臨床微生物學，E-mail：xiangyangen@126.com。

R 378.911

A

0253-4304(2016)06-0773-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.06

2016-01-26

2016-04-20)