誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備軟骨細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

趙 輝 曹 素 劉志剛

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1 骨關(guān)節(jié)外科，2 手術(shù)室，3 骨科研究所，十堰市 442000，E-mail：zhaohui719@163.com)

論著·基礎(chǔ)研究

誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備軟骨細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

趙 輝1曹 素2劉志剛3

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院1 骨關(guān)節(jié)外科，2 手術(shù)室，3 骨科研究所，十堰市 442000，E-mail：zhaohui719@163.com)

目的 探討利用誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備軟骨細(xì)胞治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的價(jià)值。方法 選擇健康新西蘭大白兔12只，其中3只用于分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSC)，將其余白兔均分為誘導(dǎo)組、空白對(duì)照組及支架組(每組3只)。建立軟骨缺損動(dòng)物模型后，空白對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)不作任何處理，支架組只將25%可注射型支架材料Pluronic F-127注入軟骨缺損區(qū)，誘導(dǎo)組將25%可注射型支架材料Pluronic F-127注射到最佳誘導(dǎo)分化的BMMSC中，再將細(xì)胞注入軟骨缺損區(qū)。干預(yù)后15 d，對(duì)各組動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損部位進(jìn)行大體觀察與顯微鏡下觀察，并進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。結(jié)果 定向誘導(dǎo)14 d后，BMMSC由梭形變?yōu)槎噙呅危纬绍浌菢咏Y(jié)節(jié)。建模后3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)活動(dòng)正常，誘導(dǎo)組術(shù)后8周關(guān)節(jié)缺損處完全填充，修復(fù)組織表面平整，軟骨下區(qū)形成新骨；其他兩組缺損持續(xù)存在，粉紅色組織填充底部。誘導(dǎo)組術(shù)后4周、8周的組織學(xué)評(píng)分分別為(6.44±1.11)分和(6.27±1.09)分，均明顯低于支架組的(10.41±1.34)分和(9.87±1.23)分(P<0.05)，也明顯低于空白對(duì)照組的(11.09±1.34)分和(9.89±1.33)分(P<0.05)。結(jié)論 誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備的軟骨細(xì)胞在體外增生分化效果好，而應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷可以最大限度地減少創(chuàng)傷。

關(guān)節(jié)軟骨損傷；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；軟骨細(xì)胞；組織工程學(xué)；實(shí)驗(yàn)研究

關(guān)節(jié)軟骨是機(jī)體可動(dòng)關(guān)節(jié)進(jìn)行光滑無摩擦運(yùn)動(dòng)的特殊狹窄層連組織，主要由軟骨細(xì)胞組成，包含Ⅱ型膠原、非膠原蛋白、蛋白聚糖、水以及膠原等[1-2]。關(guān)節(jié)軟骨在多種情況下都會(huì)造成傷害，如關(guān)節(jié)軟骨病、骨性關(guān)節(jié)炎以及創(chuàng)傷等，使患者的生活質(zhì)量明顯降低[3-4]。現(xiàn)代研究表明關(guān)節(jié)軟骨損傷多發(fā)生在髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)，且可呈漸進(jìn)性加重，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨下骨的囊性變、纖維化、硬化、關(guān)節(jié)囊增厚等，最終致關(guān)節(jié)變形而不能發(fā)揮原來的功能[5]。治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要方法是關(guān)節(jié)置換手術(shù)，但是其對(duì)于患者有一定的創(chuàng)傷，并且術(shù)后容易復(fù)發(fā)，形成關(guān)節(jié)軟骨蛻變[6]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，組織工程備受學(xué)者青睞。組織工程發(fā)展中4個(gè)因素最為重要，分別是干細(xì)胞、外部環(huán)境、細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子、能夠降解的支架材料[7-8]。有實(shí)驗(yàn)研究將非軟骨來源細(xì)胞誘導(dǎo)成為軟骨細(xì)胞，其能有效修復(fù)病損關(guān)節(jié)軟骨[9]。本研究利用軟骨組織工程技術(shù)，對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSC)進(jìn)行分離而獲得干細(xì)胞，通過誘導(dǎo)后對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷模型進(jìn)行修復(fù)，以期能夠找到軟骨組織工程理想的干細(xì)胞、支架材料與培養(yǎng)條件。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 選擇健康新西蘭大白兔12只，月齡2個(gè)月，雌雄不限，體重2.5～3.5 kg，由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：動(dòng)字第H209441號(hào)，嚴(yán)格按照潔凈級(jí)水平進(jìn)行飼養(yǎng)。可注射型支架材料Pluronic F-127購自Sigma公司；細(xì)胞分離液、胰島素、低黏度藻酸鈉、轉(zhuǎn)化生長因子β1均購自Sigma公司(生產(chǎn)批號(hào)分別為20142242、20138553、20149955、20153335)；抗兔Ⅰ、Ⅱ型膠原抗體購自武漢三鷹公司(生產(chǎn)批號(hào)分別為201503092、20145553)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組方法：選擇3只大白兔用于分離BMMSC，其余大白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為誘導(dǎo)組、空白對(duì)照組以及支架組，每組3只。

1.2.2 BMMSC的分離、常規(guī)培養(yǎng)及誘導(dǎo)培養(yǎng)：采用30 g/L戊巴比妥鈉5 ml靜脈麻醉大白兔，待完全麻醉后抽取大白兔的脛骨骨髓。隨后通過Percoll細(xì)胞分離液實(shí)現(xiàn)梯度密度，1倍磷酸緩沖鹽溶液洗滌后選擇細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)

培養(yǎng)(5% CO2和37℃)。細(xì)胞生長密度達(dá)90.0%后收集細(xì)胞，使用10 g/L藻酸鈉溶液進(jìn)行洗滌；滴入200 mmol/L氯化鈣溶液，待出現(xiàn)了藻酸鈣凝膠微球，將藻酸鈣凝膠微球在旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(上海生物工程公司)中放置；通過誘導(dǎo)形成懸浮細(xì)胞，在平面培養(yǎng)瓶中接下懸浮細(xì)胞，使其處于靜態(tài)中培養(yǎng)。其中培養(yǎng)基成分由轉(zhuǎn)化生長因子β 110 μg/L、胰島素6.25 mg/L、維生素C 50 mg/L構(gòu)成，誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。

1.2.3 建立軟骨缺損動(dòng)物模型：使用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施靜脈麻醉，大白兔取仰臥的姿勢(shì)，常規(guī)消毒，鋪無菌巾。取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，經(jīng)髕骨內(nèi)側(cè)緣將膝關(guān)節(jié)切開，將髕腱和股四頭肌肌腱拉開；使膝關(guān)節(jié)充分暴露出來，進(jìn)行直徑、深度均為5 cm的圓柱形軟骨損壞區(qū)的制作，位置是在膝關(guān)節(jié)股骨滑車處。1.2.4 干預(yù)方法：空白對(duì)照組無特殊處理；支架組只將25%可注射型支架材料Pluronic F-127注入軟骨缺損區(qū)，然后逐層縫合；誘導(dǎo)組先將25%可注射型支架材料Pluronic F-127注射到最佳誘導(dǎo)分化的BMMSC中，注射環(huán)境為 4℃，使重懸細(xì)胞終濃度為5×1010/L，后采用預(yù)冷注射器將重懸細(xì)胞注入軟骨缺損，然后逐層縫合。干預(yù)后各組也嚴(yán)格按照潔凈級(jí)水平進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo) (1)觀察并詳細(xì)記錄BMMSC的鑒定以及體外誘導(dǎo)培養(yǎng)情況；(2)在干預(yù)后15 d，對(duì)動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)部位進(jìn)行大體觀察與顯微鏡下觀察；(3)在干預(yù)后15 d，參照文獻(xiàn)[3]的方法，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSC誘導(dǎo)培養(yǎng)情況 BMMSC常規(guī)培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)細(xì)胞貼壁，5 d后可見多角細(xì)胞細(xì)胞以及梭形細(xì)胞呈團(tuán)簇狀生長，見圖1a。向軟骨方向定向誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)第2天可見少量的單個(gè)梭形細(xì)胞變?yōu)槎噙呅危梢钥吹叫螤罴?xì)長的偽足，見圖1b，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長，越來越多的細(xì)胞的形狀有所改變，見圖1c；在15 d左右細(xì)胞形狀變?yōu)閳A形，出現(xiàn)團(tuán)裝的細(xì)胞集聚，形成軟骨樣結(jié)節(jié)，見圖1d。

圖1 BMMSC誘導(dǎo)培養(yǎng)情況(×200)

2.2 關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)情況 手術(shù)后各組動(dòng)物膝關(guān)節(jié)均能正常活動(dòng)，創(chuàng)口愈合良好。誘導(dǎo)組術(shù)后8周關(guān)節(jié)處不再出現(xiàn)缺損的地方，與周圍正常關(guān)節(jié)軟骨分界不明顯；其他兩組出現(xiàn)凹陷，底部由粉紅色組織填充。顯微鏡下觀察誘導(dǎo)組術(shù)后8周的修復(fù)組織表面平整，細(xì)胞核清晰，軟骨下區(qū)形成新骨；其他兩組缺損持續(xù)存在，底部由粉紅色組織填充。

2.3 關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分 誘導(dǎo)組術(shù)后4周、8周的組織學(xué)評(píng)分均明顯低于支架組及空白對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 3組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)組織學(xué)評(píng)分比較(x±s，分)

注：與誘導(dǎo)組比較，*P<0.05。

3 討 論

身體的多個(gè)關(guān)節(jié)處都可能引發(fā)軟骨組織的損傷，以膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)最為常見。目前軟骨關(guān)節(jié)炎在骨科臨床上越來越常見，其往往由運(yùn)動(dòng)損傷、軟骨磨損以及關(guān)節(jié)退行性變等引起[10]。許多晚期骨關(guān)節(jié)炎患者在關(guān)節(jié)置換術(shù)后癥狀得以緩解，然而很多患者的病情沒有達(dá)到晚期，因此沒有獲得良好的治療效果，而病情仍對(duì)其生活造成極大影響。雖然關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)組織中代謝能力較強(qiáng)的組織，然而基質(zhì)中軟骨細(xì)胞的更新?lián)Q代率較低，因此軟骨損傷后很難進(jìn)行自我修復(fù)[11]。關(guān)節(jié)面過度損傷通常容易發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎，輕度關(guān)節(jié)軟骨損傷會(huì)使損傷發(fā)展甚至退變，造成嚴(yán)重的后果[12]。

目前關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療方法包括移植技術(shù)、關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)腔灌洗和清理術(shù)、降低關(guān)節(jié)面應(yīng)力及保持關(guān)節(jié)活動(dòng)、關(guān)節(jié)面鉆孔及微骨折術(shù)、藥物治療等，但每種方法都因其自身的缺點(diǎn)而不能很好地應(yīng)用于臨床[13]。組織工程學(xué)技術(shù)是一種全新的關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)技術(shù)，該技術(shù)需細(xì)胞生長因子、干細(xì)胞、組織結(jié)構(gòu)以及可降解的支架材料的支持[14]。在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中，轉(zhuǎn)化生長因子β1能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的分化，加速合成、分化以及增殖軟骨細(xì)胞DNA。維生素C是一種抗氧化劑，可抑制或減少凋亡的產(chǎn)生。特別是BMMSC再生性能較強(qiáng)，同時(shí)衰老性能較低，因此能夠使軟骨細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)且不改變其形狀[15]。本研究顯示14 h的定向誘導(dǎo)完成后，BMMSC有一個(gè)形狀的改變過程，改變的順序是梭形、多邊形、類圓形，最后細(xì)胞集聚構(gòu)成軟骨樣結(jié)節(jié)，表明誘導(dǎo)效果良好，使利用組織工程技術(shù)進(jìn)行組織工程軟骨的構(gòu)建有了干細(xì)胞的物質(zhì)保障。

程艷偉等[16]將BMMSC通過軟骨組織工程技術(shù)分離成干細(xì)胞，然后采用成骨細(xì)胞對(duì)生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)，最后與支架材料復(fù)合置于三維培養(yǎng)條件，在關(guān)節(jié)骨軟骨缺損深層置入構(gòu)建的骨軟骨復(fù)合體，觀察其修復(fù)的情況；而新近有研究表明成軟骨分化的重要因素是在微重力環(huán)境下動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方式[17]；因此，為了對(duì)微重力環(huán)境進(jìn)行模擬，盡可能達(dá)到最理想的狀態(tài)，本研究使用了旋轉(zhuǎn)式細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，同時(shí)使得細(xì)胞間物質(zhì)傳遞效率得以提升，使細(xì)胞承受較低的剪切力，從而使得細(xì)胞分化質(zhì)量得以提升。本研究中各組均未發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤，說明其生物相容性較好，不存在抗原性；誘導(dǎo)組術(shù)后4周與8周的組織學(xué)評(píng)分均明顯低于支架組及空白對(duì)照組(P<0.05)，說明誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備軟骨細(xì)胞能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，這為應(yīng)用新型干細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨提供了新思路。

總之，誘導(dǎo)干細(xì)胞技術(shù)制備的軟骨細(xì)胞在體外增生活躍，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，而應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷可以最大限度地減少創(chuàng)傷，為組織工程方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷提供了實(shí)驗(yàn)參考。

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Experimental research on chondrocytes prepared by induced stem cells technology for treating articular cartilage injury in animal

ZHAOHui1,CAOSu2,LIUZhi-gang3

(1DepartmentofOrthopedics,2OperationRoom,3OrthopedicsInstitute,DongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

Objective To investigate the value of chondrocytes prepared by induced stem cells technology for treating articular cartilage injury.Methods Of 12 healthy New Zealand rabbits selected,3 rabbits were used to isolate the bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSC),the remaining rabbits were equally divided into the induction group,blank control group and stent group,with 3 rabbits in each group.After the establishment of the cartilage defect animal model,no treatment was performed in the articular cartilage defect in the blank control group,25% injectable scaffold Pluronic F-127 was injected into cartilage defect in the stent group.And in the induction group,25% injectable scaffold Pluronic F-127 was injected into BMMSC with optimum induce differentiation,then the cells were injected into cartilage defect.After 15 days of intervention,gross and under-microscope observation on articular cartilage defects was conducted in each group,and the histological scoring was also performed.Results In BMMSC,spindle-shape turned into polygon-shape,and cartilage-like nodules was formed after 14 days of directional induction.After modeling,the movement of knee joints was normal in the rabbits of the three groups.At postoperative 8 weeks,the cartilage defect of induction group was completely filled,the surface of repaired tissues was smooth,and the formation of new bone was found in the subchondral region.But the defects remained existing,and the pink tissues were filled into the bottom in the other two groups.The histological scores of postoperative 4 and 8 weeks were 6.44±1.11 and 6.27±1.09 in the induction group respectively,and were significantly lower than those in either the stent group(10.41±1.34 and 9.87±1.23 respectively,P<0.05) or the blank control group(11.09±1.34 and 9.89±1.33 respectively,P<0.05).Conclusion The chondrocytes prepared by induced stem cells has a good effect on differentiation and proliferation in vitro,and can alleviate the trauma when being applied to the treatment of articular cartilage injury.

Articular cartilage injury,Bone marrow mesenchymal stem cells,Chondrocytes,Tissue engineering,Experimental study

趙輝(1975～)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：骨關(guān)節(jié)。

曹素(1981～)，女，本科，主管護(hù)師，研究方向：骨科，E-mail：caosu615@163.com。

R 684.76

A

0253-4304(2016)06-0762-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.06.03

2016-01-04

2016-04-07)