人乳頭狀瘤病毒不同亞型感染與宮頸病變程度關系研究

龐小芬 王佳麗 石丹麗 陳昌賢 莫凌昭

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，南寧市 530021，E-mail：1334049578@qq.com)

臨床創新

人乳頭狀瘤病毒不同亞型感染與宮頸病變程度關系研究

龐小芬 王佳麗 石丹麗 陳昌賢 莫凌昭

(廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科，南寧市 530021，E-mail：1334049578@qq.com)

目的 探討人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與宮頸病變的相關性。方法 采用凱普人乳頭狀瘤病毒核酸擴增分型檢測方法檢測217例宮頸細胞學正常/炎癥患者(對照組)、131例高級別宮頸上皮內瘤變(CINⅡ～Ⅲ組)、338例宮頸癌(宮頸癌組)患者HPV基因。3組患者又根據年齡不同分為年輕組(≤35歲)和中老年組(≥35歲)，根據民族分為漢族和少數民族兩組，分別比較各組患者HPV感染率與年齡、民族的關系。結果 (1)對照組HPV感染率為20.74%(45/217)，明顯低于CINⅡ～Ⅲ組的86.26%(113/131)、宮頸癌組的90.53%(306/338)(P均<0.05)，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV感染率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。(2)對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組HPV多重感染率分別為11.11%、27.43%、19.28%，CINⅡ～Ⅲ組多重感染率明顯高于對照組(P<0.05)。(3)常見的亞型檢出率： HPV16為41.25%，HPV18為10.35%，HPV58為9.33%，HPV52為6.27%，HPV33為3.94%。logistic回歸分析顯示：感染HPV16、58、52、33型患CINⅡ～Ⅲ的風險升高(P<0.05)；感染HPV16、18、58、52型患宮頸癌的風險升高(P<0.05)。(4)對照組患者中，年輕組HPV感染率高于中老年組(P<0.05)，宮頸癌組中，中老年組HPV感染率高于年輕組(P<0.05)，CINⅡ～Ⅲ組患者中，年輕組與老年組HPV感染率無差異(P>0.05)。結論 HPV感染率隨宮頸病變嚴重程度加重呈升高；HPV多重感染可能是宮頸病變加重的重要因素；HPV16、18、58、52、33型與宮頸病變密切相關。

宮頸癌；宮頸上皮內瘤變；人乳頭狀瘤病毒；基因分型

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的健康和生命。在我國，每年新增宮頸癌患者約13.5萬，占全球發病數量的1/3[1]。宮頸癌的發生發展是宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-原位癌-早期浸潤癌-浸潤癌的連續發展過程，期間可經歷10～15年。故在此過程中，對宮頸病變特別是宮頸癌的篩查、早期診治十分關鍵。目前認為人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus，HPV)，特別高危型別HPV的持續性感染是引起宮頸癌的基本原因。故HPV的篩查是早期發現和預防宮頸癌的重要手段，對HPV特別是高危型HPV的監測及分型研究對預測宮頸病變的進展、判斷預后、指導治療有重要價值。本文檢測對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者HPV感染情況，以了解HPV感染與宮頸上皮內瘤變、宮頸癌的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年8月至2013年8月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院就診的CINⅡ～Ⅲ患者131例，年齡24～75歲，宮頸癌患者338例，年齡21～79歲，均經我院病理檢查確診。選取同期接受宮頸薄層液基細胞學檢測并顯示宮頸細胞正?；蜓仔苑磻约毎淖兊姆菍m頸病變患者217例為對照組，年齡19～75歲。所有患者按年齡不同分為年輕組(≤35歲)和中老年組(>35歲)，根據民族不同分為漢族和少數民族組。

1.2 試劑及儀器 HPV DNA抽提試劑盒(QIA Mini試劑盒，德國Qiagen公司)；HPV基因分型檢測試劑盒(中國凱普生物科技有限公司)；擴增儀(GeneAmp 9700，美國ABI公司)；醫用核酸分子快速雜分儀(中國凱普生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集：標本采樣前3 d內不用陰道內藥物，不行陰道沖洗，前1 d起禁止性生活。由婦科醫師用陰窺器暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，將宮頸刷伸入宮頸口處，輕輕轉動宮頸刷，順時針旋轉3～5周，慢慢抽出宮頸刷，將其放入含專用保存液的小瓶中，旋緊瓶蓋，標記好送檢驗室檢測。1.3.2 標本DNA提?。喝∩鲜鲆后w0.5 ml，13 000 r/min離心1 min，棄上清液，利用QIA Mini試劑盒提取DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3.3 HybriMax法檢測21種HPV亞型：(1)標本DNA擴增： 將水、PCR MIX、Taq酶和DNA模板按要求混勻，反應體系為25 μl。PCR反應條件為20℃10 min，95℃預變性9 min；95℃ 20 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s→95℃ 20 s，共40個循環后，72℃延伸5 min，最后將溫度維持在4℃。(2)導流雜交： 將擴增后的PCR產物加熱變性后冰浴，同時將固定有特異性核酸探針的膜固定在雜交儀上，進行預雜交。把PCR產物加到薄膜上，讓樣品流入膜內進行導流雜交，清洗除去未結合的DNA，整個雜交過程保持在45℃。(3)芯片顯色： 用封阻液封閉膜，孵育5 min，重復2次。排出封阻液后加入酶標液，25℃溫育3.5 min。用沖洗緩沖液徹底沖洗膜，除去未結合的酶標液，后加入NBT/BCIP底物顯色3～5 min。在顯色后1 h內分析結果。

1.3.4 結果判定：固定有特異性核酸探針的膜共分隔成21個小圓，每個圓點表示一種HPV型別，21種HPV分為高危型和低危型兩類：高危型15種，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、68、59、66、68；低危型6種，包括HPV6、11、42、43、44、CP8304。顯示為紫藍色圓點提示該HPV型別檢測結果陽性，兩個或兩個以上圓點顯色者為多亞型感染。

1.4 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計數資料率的比較采用χ2檢驗；采用logistic回歸進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者HPV感染情況 對照組217例，HPV感染率為20.74%；CINⅡ～Ⅲ組131例，HPV感染率為86.26%；宮頸癌組338例，HPV感染率為90.53%。宮頸癌組HPV感染率高于CINⅡ～Ⅲ組、對照組(χ2=141.474，P<0.001)，CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV感染率無差異(χ2=1.810，P=0.185)。對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組高危型HPV感染率分別為97.78%、98.23%、98.69%。見表1。

表1 3組患者HPV感染率 及高危型HPV感染構成比較(%)

2.2 各組患者HPV多重感染情況 對照組多重感染5例，其中二重感染4例，以HPV16與其他型別合并感染為主，共3例。CINⅡ～Ⅲ 組多重感染31例，其中二重感染24例，HPV16與其他型別合并感染為主，占58.06%(18/31)，并以HPV16+18、HPV16+52、HPV16+58多見。宮頸癌組多重感染59例，其中二重感染47例，合并HPV16感染占多重感染47.46%(28/59)，以HPV16+52、HPV16+18、HPV16+58等多見。3組患者的HPV感染均以二重感染為主，其中對照組和CINⅡ～Ⅲ 組主要以合并HPV16感染為主。3組多重感染率比較，差異有統計學意義(χ2=4.874，P=0.035)，CINⅡ～Ⅲ組HPV多重感染率高于對照組(P<0.05)，對照組與宮頸癌組、CINⅡ～Ⅲ組與宮頸癌組HPV多重感染率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組患者HPV多重感染情況(%)

2.3 HPV亞型的分布及其與CINⅡ～Ⅲ、宮頸癌的關系 本研究3組共686例患者，檢出HPV感染464例，21種HPV亞型中，除HPV43亞型未檢出外，其他20種HPV亞型均被檢出。3組患者16、18、58、52和33亞型檢出率比較，差異有統計學意義(χ2=114.870、36.548、28.102、15.823、26.910，P均<0.001)，其余亞型檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。采用logistic回歸分析顯示： 16型(OR=7.017，95% CI=4.114～11.970，P<0.001)、58型(OR=6.782，95% CI=2.977～15.450，P<0.001)、52型(OR=8.884，95% CI=1.915～41.212，P=0.001)、33型(OR=27.934，95% CI=3.644～214.115，P<0.001)HPV感染患CINⅡ～Ⅲ的風險升高。16型(OR=9.778，95% CI=6.155～15.534，P<0.001)、18型(OR=7.437，95%CI=3.151～17.551，P<0.001)、58型(OR=2.452，95% CI=1.099～5.469，P=0.024)、52型(OR=10.855，95%CI=2.571～45.839，P<0.001)HPV感染者患宮頸癌的風險升高。

表3 3組患者 HPV亞型感染分布情況(n，%)

注：多型感染，各亞型單獨計數統計；#P<0.05。

2.4 各組內不同年齡、民族患者HPV感染率的比較 對照組患者平均年齡41.97歲(95%可信區間為：40.65～43.32歲)；CINⅡ～Ⅲ組患者平均年齡42.98歲(95%可信區間為：41.33～44.63歲)；宮頸癌組患者平均年齡50.11歲(95%可信區間為：48.97～51.26歲)；3組患者均以35歲為界分為年輕組(≤35歲)、中老年組(>35歲)。對照組中，年輕組HPV感染率明顯高于中老年組患者(P<0.05)；宮頸癌組中，老年患者HPV感染率明顯高于年輕組患者(P<0.05)；CINⅡ～Ⅲ組中，年輕組患者與中老年組患者HPV感染率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。將3組患者分為漢族和少數民族。對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者中漢族與少數民族HPV感染率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組內年齡、民族患者HPV感染率的比較(%)

3 討 論

流行病學調查顯示，HPV感染是宮頸癌前病變和宮頸癌的主要致病因子，目前已經分離出130多種HPV亞型，其中30余種與下生殖道良性疣及宮頸癌有密切關系。根據與女性生殖道腫瘤的關系，HPV被分為高危型和低危型，其中HPV6、11、42、43、44、CP8304屬低危型，一般不誘發癌變，多見于生殖道良性病變；HPV16、18、31、33、35、45、52、58等屬高危型，與宮頸癌的發生關系最為密切。本研究中，CINⅡ～Ⅲ組HPV感染率為86.26%、宮頸癌組為90.53%，均明顯高于對照組的20.74%(P<0.05)，3組患者均以含高危型HPV感染為主。說明CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌與高危型HPV感染密切相關。

根據感染HPV病毒不同，可以分為單一感染和多重感染，多重感染中常見的有二重感染、三重感染，或者更多亞型的合并感染。目前研究雖然在單一HPV感染和多重HPV感染在宮頸疾病的發生發展、病情評估及預后影響上存在不同的意見，但均認為多重感染與宮頸病變之間存在密切關系[2]。陶萍萍等[3]采用凱普導流雜交HPV DNA檢測各種宮頸病變，結果顯示隨著病變程度的升級，多重感染率逐漸增加，提示多重感染可能與宮頸病變的進展有關。本研究結果顯示，對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組患者多重感染率分別為11.11%、27.43%、19.28%，CIN Ⅱ～Ⅲ組多重感染率明顯高于對照組(P<0.05)。提示多重感染可能在一定程度上有促進宮頸病變加重的作用。但宮頸癌的多重感染率卻低于CINⅡ～Ⅲ組患者，并且與對照組的多重感染率比較無差異(P>0.05)。這與多重感染促進宮頸病變加重的觀點并不符合，可能是由于宮頸癌患者子宮頸腫物壞死組織較多，影響取樣，導致宮頸癌患者HPV亞型檢測結果產生偏差。3組患者多重感染均以二重感染為主，最常見的二重感染型別為HPV16+52、HPV16+18、16+58等。多重感染中含有HPV16的混合感染所占比例最高。由此可見，無論在二重感染還是多重感染中，HPV16都是最主要的感染型別。

有研究顯示，CIN和宮頸癌患者的HPV感染型別和分布在不同區域有一定的差異[4]。不同亞型的HPV感染其致病后果不同，HPV陽性的宮頸癌患者中，HPV16型感染率最高[5]。本研究中，對照組、CINⅡ～Ⅲ組、宮頸癌組均以HPV16型感染為主要類型。 除HPV16型外，其他20種亞型分布則各有不同，有文獻報告[5]在拉丁美洲最常見的是33型，其次是39、59型，而在亞洲國家最常見的是58、52型。張東紅等[6]研究發現，我國宮頸癌HPV感染以HPV16、18、58為主，特別在南方長江中下游地區，58型感染僅次于16型。本研究HPV各亞型檢出率排序為HPV16(41.25%)、18(10.35%)、58(9.33%)、52(6.27%)、33(3.94%)。HPV16型和18型檢出率均大于10%。logistic回歸分析結果顯示：CIN Ⅱ～Ⅲ的主要風險是感染HPV16、58、52、33型；宮頸癌的主要風險是感染HPV16、18、58、52型。猜測HPV16、58、52型是CINⅡ～Ⅲ和宮頸癌共同的危險因素；HPV33型可能與CINⅡ～Ⅲ關系更為密切，而感染HPV18型則可能更容易引起宮頸癌。

近年來宮頸癌的發病有明顯年輕化趨勢。本組宮頸癌患者最小年齡為23歲，平均年齡50.11歲。將3組患者分別分為年輕組(≤35歲)、中老年組(>35歲)，發現宮頸癌組的中老年患者HPV感染率(91.88%)明顯高于年輕患者(76.67%)(P<0.05)，說明宮頸癌患者年齡越大的HPV感染率越高，考慮這可能與患者的免疫力下降及激素水平波動大等有關。而在對照組中，HPV感染率則是年輕患者(31.48%)高于中老年患者(19.16%)(P<0.05)，可能由于年輕女性性生活較頻繁，性伴侶多，且免疫系統未被致敏，易受HPV病毒感染。宮頸細胞學形態正常，但可檢出HPV-DNA，相關文獻稱之為隱匿感染[7]。若這種HPV感染不及時消退，可能會進一步發展，導致宮頸細胞學形態改變，引起宮頸癌前病變或宮頸癌。對照組的年輕患者HPV感染率較高從另一方面也反映了宮頸癌年輕化。有文獻報道，不同地域、不同民族間因為文化差異、生活習慣等因素可導致HPV感染譜不同[8]。廣西是多山地區，少數民族多集中居住在邊遠山區。此次調查的患者中涉及多個民族，3組患者均包含有多個少數民族，如壯族、苗族、仫佬族等，本研究提示各民族HPV感染率比較無差異。

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龐小芬(1990～)，女，碩士，研究方向：婦科腫瘤。

莫凌昭(1971～)男，博士，副教授，研究方向：婦科腫瘤學，E-mail：1279512058@qq.com。

R 737.33

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0253-4304(2016)10-1430-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.25

2016-04-18

2016-07-22)