支原體固體培養與液體培養在支原體感染診斷中的應用效果比較▲

黃秀榮 張群先 劉愛菊 陸 爽 梁慧娜 黃麗月

(廣西河池市人民醫院檢驗科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

臨床創新

支原體固體培養與液體培養在支原體感染診斷中的應用效果比較▲

黃秀榮 張群先 劉愛菊 陸 爽 梁慧娜 黃麗月

(廣西河池市人民醫院檢驗科，河池市 547000，E-mail：wangxiaoli5081@126.com)

目的 比較固體培養及液體培養在支原體感染診斷中的應用效果。方法 采用固體培養基和液體培養基平行檢測628例泌尿生殖道標本的支原體感染情況，比較兩種方法的檢出陽性率及污染率，對液體培養陽性而固體培養陰性、液體培養陰性而因體培養陽性的標本進行分析。結果 固體培養法的檢出陽性率為45.86%(288/628)，液體培養法的為49.36%(310/628)。固體培養法的污染率為1.91%，低于液體培養法的8.44%(P<0.05)。液體培養陽性而固體培養陰性共42例，經液體培養傳代后取其紅色培養液轉種到固體培養基上再次培養，有13例(2.07%)長出支原體典型菌落，且原固體培養經延長培養時間(延長24 h)后也出現少數支原體典型菌落。液體培養陰性而固體培養陽性共20例(3.18%)，取其液體培養的紅色渾濁培養液轉種到固體平板培養再次培養，可見有支原體生長。結論 液體培養污染率大、易誤診，但可快速檢測藥敏結果；固體培養污染率低，且能直接觀察到支原體屬特有的典型菌落，兩者結合診斷對指導臨床治療具有較好的臨床應用價值。

支原體感染；固體培養；液體培養

支原體是一種最小的原核細胞型微生物，能夠在無生命的培養基上繁殖生長，其種類繁多、分布廣泛，具有很強的傳染性，主要感染泌尿生殖系統，嚴重影響人們的身心健康，甚至導致不育不孕等，降低人們的生活質量。支原體感染前期患者無癥狀或癥狀不明顯，因此未能得到及時診斷、治療。目前我國實驗室檢測支原體常用的方法是液體培養法，該方法方便、快捷、靈敏度高，但液體培養法只是通過添加不同底物進行生化反應而間接判斷結果，存在假陽性，且存在較為嚴重的污染問題。固體培養法能夠準確觀察支原體的菌落形態，有一定的優越性。本研究采用固體培養基和液體培養基對628份泌尿生殖道標本進行平行檢測，分析其檢出陽性率、污染率等，為臨床提供診斷參考依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 2014年4～8月我院婦科、皮膚性病科、泌尿外科收集的泌尿生殖道標本628份，其中女性332例，年齡11～54歲，男性296例，年齡18～62歲。均采用無菌拭子取尿道分泌物或宮頸分泌物，同一患者均取雙份標本，采集后及時送檢。

1.2 試劑與儀器 所用的液體培養基為解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，Uu)和人型支原體(Mycoplasmahominis，Mh)分離、鑒定、藥敏試劑盒(由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；批號：20140122)；固體培養基為Uu和Mh的選擇性培養基(由江門市凱林貿易有限公司提供；批號：140311)。儀器選用普通的光學顯微鏡(BX43奧林巴斯)和上海比朗智能生化培養箱、常州冠軍CHP-160二氧化碳培養箱。

1.3 培養方法 標本一般在收集后2 h內接種。固體培養基培養：將其中一份標本拭子直接滾動涂劃在固體培養基上，編號后放入二氧化碳培養箱培養。液體培養基培養：將另一份拭子標本置入液體培養基內反復攪拌并在瓶壁內擠壓，盡量把全部樣本都洗于培養液中，丟棄棉拭子，然后取100 μl混合液置入檢測板各孔中，滴加礦物油覆蓋，然后將檢測板條放入生化培養箱，35～37℃條件下孵育。

1.4 結果觀察與判定 (1)固體培養：培養48 h后(若陰性則延長到60 h后觀察)在低倍鏡下觀察固體瓊脂平板上是否有支原體屬特征性菌落生長。若見到典型棕褐色海膽樣支原體菌落(菌落中有沙粒狀物質，直徑10～50 μm)為Uu陽性，若見到煎蛋樣支原體菌落(直徑100～300 μm)為Mh培養陽性，若同時見到上述兩種菌落則為Uu、Mh混合陽性，若無典型菌落生長，則為陰性。(2)液體培養：培養48 h后觀察結果。培養液由黃色變為紅色且澄清者判定為陽性，無顏色變化或顏色變紅但出現明顯混濁或沉淀者判定為陰性。(3)污染判定：固體瓊脂平板上有雜菌生長并影響結果觀察則判為固體培養污染；液體培養液變紅但出現明顯渾濁或沉淀的則判為液體培養污染。

2 結 果

2.1 固、液體培養結果及檢出陽性率的比較 628例泌尿生殖道標本，固體培養陽性288例(45.86%)，陰性340例(54.14%)，其中固體培養有12例雜菌生長嚴重影響結果觀察而判定為陰性；液體培養陽性310例(49.36%)，陰性318例(50.64%)，53例培養液為紅色渾濁而判定為陰性。

2.2 固、液體培養法污染率的比較 固體培養有12例雜菌生長嚴重影響結果判斷，污染率為1.91%；液體培養有53例培養液紅色渾濁，污染率為8.44%，液體培養污染率高于固體培養，差異有統計學意義(χ2=27.27，P<0.05)。

2.3 液體培養陽性而固體培養陰性、液體培養陰性而固體培養陽性的標本二次固體培養結果 固、液體培養同時為陽性268例，同時為陰性298例。液體培養陽性而固體培養陰性共42例。將42例經液體培養傳代后取其紅色培養液轉種到固體培養基上再次培養，有13例(2.07%)長出支原體典型菌落，且原固體培養經延長培養時間(延長24 h)后也出現少數支原體典型菌落；其余29例，經液體培養傳代后取其紅色培養液二次固體培養和延長原固體培養時間(延長24 h)均無支原體菌落生長。

液體培養陰性而固體培養陽性共20例，均為液體培養后的培養液為紅色渾濁而判定為陰性，而在原固體培養可見到支原體典型菌落。這20例(3.18%)取其液體培養的紅色渾濁培養液轉種到固體平板再次培養，可見有支原體生長。其余液體培養時培養液為紅色渾濁而判定為陰性的33例，原固體培養無支原體生長，取其紅色渾濁培養液轉種到固體平板培養也無支原體生長。

3 討 論

本研究對628例泌尿生殖道標本分別采用液體培養、固體培養法檢測支原體，結果顯示液體培養檢出率為49.36%(310/628)，固體培養法檢出率為45.86%(288/628)，與陳紅霞等[1]報告相似。目前我國使用的支原體液體培養試劑是商品化試劑盒，操作十分簡便，是利用培養與生化反應相結合的原理進行支原體培養、鑒定、計數和藥敏測定。Uu具有脲酶，能分解尿素產生氨或胺，Mh具有精氨酸脫羧酶分解精氨酸也產生氨氣，均可使培養液的pH升高，指示劑變紅色，加上支原體個體微小，生長繁殖后也不會使培養液出現渾濁或生成沉淀，因此以培養48 h內液體變紅且澄清者判定為陽性。但這種生化反應特異性較差，不是支原體所特有，極少量堿性標本也可會直接導致培養液變紅，從而出現假陽性；此外盡管培養液有多種抗生素可抑制雜菌生長，但由于臨床上抗生素濫用，有可能導致檢測標本中含有少數有分解尿素或精氨酸能力的耐藥菌株，從而引起假陽性反應。本研究中，有29例初次液體培養陽性而固體培養陰性，但經液體培養傳代后二次固體培養和延長原固體培養時間均無支原體菌落生長，如根據首次液體培養結果進行診斷，可導致誤診。同時，液體培養陰性而固體培養陽性共20例(3.18%)，而取其液體培養的紅色渾濁培養液轉種到固體平板再次培養均可見有支原體生長，這一比例低于周良佳[2]報告的結果，可能和標本類型、所用試劑廠家不同有關。液體培養時可因培養液變紅色并出現渾濁可導致假陰性，而培養液變紅色且渾濁的原因有：(1)細菌或真菌污染標本引起渾濁，同時伴有支原體生長；(2)標本的上皮細胞、白細胞或黏液過多引起渾濁，同時有支原體生長[3]；(3)無支原體生長，具有分解尿素或精氨酸能力的細菌、真菌污染引起。由此可見，僅憑顏色變化和是否渾濁來判定液體培養的結果會導致假陽性和假陰性，也無法判斷那些紅色渾濁標本是否有支原體生長，從而造成漏檢[4]。因此，在對渾濁培養液進行判斷時，應該加用固體培養基進行確認。

含有支原體生長營養成分的固體培養基，抑菌能力較強[5]，特異性好，與液體培養相比其有很大優勢：(1)首先培養24～48 h后固體培養基上長出低倍鏡下可以觀察的典型的支原體菌落，不會出現假陽性，結果可靠；(2)其次在固體瓊脂平板上可以同時鑒別不同的支原體，有利于支原體的分類和純化。在本次實驗中，我們發現在培養24 h后固體培養基上就可見到Uu和Mh菌落，48 h后菌落形態更加典型，Uu呈典型海膽樣菌落(10 ～50 μm)或不典型微小型、空泡型支原體樣菌落[6]，Mh呈油煎蛋樣菌落(100～300 μm)；再者固體培養基上少有其他雜菌生長，即使有少量生長也不影響支原體的生長和觀察[7]。本研究中，有37例在固體培養基上有雜菌生長，但其中25例雜菌菌落少，不影響支原體生長和觀察，只有12例長滿雜菌影響結果觀察而判為陰性，污染率為1.91%，與潘新娣等[8]報告相似，且污染率明顯低于液體培養(P<0.05)。本研究結果顯示，液體培養陽性而固體培養陰性的42例標本中，有13例經液體培養傳代后固體培養長出支原體典型菌落，而原固體培養經延長培養時間(約24 h)也出現少數支原體典型菌落。其原因可能是原標本含支原體量太少，直接接種到固體瓊脂平板上的菌落極少，在顯微鏡下不易發現，或是固體瓊脂平板放置過久，瓊脂水分蒸發，支原體難于生長。因此，當液體培養出現陽性而固體培養陰性時最好延長固體培養時間，以免漏檢。

綜上所述，液體培養僅靠顏色、清濁度來判讀結果，主觀性強，無法確認支原體是否存在，臨床實驗中由于標本易污染常出現誤診或漏診，但該方法操作簡便、快捷，又附帶藥敏結果，可作為支原體檢測的初篩試驗；固體培養可直接觀察到支原體特有典型菌落而確證支原體的存在，其污染率小，不易漏診，可作為支原體檢測的確認試驗；兩種方法聯合使用具有快速、準確的檢測效果，且具有培養與藥敏同時進行的特點，可提高支原體感染診斷的準確性，從而提高治療療效，特別是針對癥狀明顯、療效不佳、反復發作的患者。

[1] 陳紅霞,陶日新,楊振強,等.液體培養法檢測泌尿生殖道支原體屬的效果評價[J].中華醫院感染學雜志,2011,21(23):5 092-5 094.

[2] 周良佳,連大帥,許 鍇,等.現有液體培養法檢測解脲脲原體效果的評價[J].中國人獸共患病學報,2015,31(1):16-20.

[3] 陳佑明,勞小斌,劉京平.泌尿生殖道支原體液體顯色培養法與固體培養法的比較[J].熱帶醫學雜志,2008,8(1):45-46,42.

[4] 邢建明,李 剛,張雅琴,等.兩種不同培養方法檢測解脲、人型支原體結果平行性分析[J].中國衛生檢驗雜志,2010,20(6):1 442-1 443.

[5] 楊曉華,譚 南,林愛心.泌尿生殖道支原體液體培養法檢測的實驗評價[J].檢驗醫學與臨床,2010,7(6):531-532.

[6] 周運恒,馬紅霞,曹廣亞,等.兩種培養方法檢測解脲脲原體及其菌落形態學的比較研究[J].檢驗醫學,2013,28(5):362-365.

[7] 李 婷,葉元康.固體培養基直接分離解脲脲原體和人型支原體方法的研究[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(10):1 081.

[8] 潘新娣,施前鋒,邵偉芳.支原體屬固體與液體培養相結合在臨床感染診斷中的應用[J].中華醫院感染學雜志,2013,23(4):949-951.

廣西河池市科學研究與技術開發計劃(河科推1430-4)

黃秀榮(1972～)，女，碩士研究生，副主任技師，研究方向：微生物檢驗。

R 518.9

A

0253-4304(2016)10-1455-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.34

2016-04-20

2016-07-01)