腦脊液細(xì)菌16S核糖體RNA基因檢測(cè)在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應(yīng)用價(jià)值▲

鄭可魯 楊思達(dá) 高媛媛 陳文雄 黃怡玲 張雅妮

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童神經(jīng)內(nèi)科，廣州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

論著·臨床研究

腦脊液細(xì)菌16S核糖體RNA基因檢測(cè)在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應(yīng)用價(jià)值▲

鄭可魯 楊思達(dá) 高媛媛 陳文雄 黃怡玲 張雅妮

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心兒童神經(jīng)內(nèi)科，廣州市 510623，E-mail：zhao86453@163.com)

目的 探討腦脊液細(xì)菌16S 核糖體RNA(16S rRNA)基因檢測(cè)在抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒中的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇化膿性腦膜炎患兒60例，在抗生素使用早期及后期采集腦脊液標(biāo)本，同時(shí)進(jìn)行16S rRNA基因檢測(cè)及細(xì)菌培養(yǎng)，比較兩種方法的檢測(cè)陽(yáng)性率，分析抗生素應(yīng)用時(shí)間對(duì)兩種檢測(cè)方法結(jié)果的影響。結(jié)果 腦脊液16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性21例(35.0%)，腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性9例(15.0%)，16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性率高于細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)。抗生素應(yīng)用早期16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性率略高于抗生素應(yīng)用后期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；抗生素應(yīng)用早期腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率高于抗生素應(yīng)用后期(P<0.05)。結(jié)論 對(duì)于抗生素治療后化膿性腦膜炎患兒，腦脊液16S rRNA基因檢出陽(yáng)性率高于腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)，且可能更少受抗生素應(yīng)用時(shí)間的影響。

化膿性腦膜炎；抗生素；腦脊液；16S 核糖體RNA；細(xì)菌培養(yǎng)；基因檢測(cè)

化膿性腦膜炎是一種小兒常見(jiàn)的疾病，其發(fā)病急，若不及時(shí)治療，患兒會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重后遺癥，嚴(yán)重者甚至死亡[1-2]。近年來(lái)，由于抗生素廣泛使用，兒童化膿性腦膜炎的臨床表現(xiàn)趨于不典型，診斷難度加大。傳統(tǒng)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)多需要48 h以上，藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果則需要72 h，且培養(yǎng)陽(yáng)性率不高，極大限制了腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)的應(yīng)用[3-4]。抗生素治療后期，腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陰性，而腦脊液常規(guī)和生化檢測(cè)卻持續(xù)異常，導(dǎo)致停用抗生素缺乏足夠依據(jù)。過(guò)早停藥會(huì)增加病情遷延、復(fù)發(fā)的概率；長(zhǎng)時(shí)間用藥則增加患兒痛苦及其家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且易致耐藥菌產(chǎn)生，不符合抗生素使用原則[5-6]。本研究以60例小兒化膿性腦膜炎患兒為研究對(duì)象，對(duì)患兒腦脊液進(jìn)行16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA，16S rRNA)基因檢測(cè)分析，并與腦脊液細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，分析抗生素應(yīng)用時(shí)間對(duì)腦脊液細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月至2016年3月在我院就診的化膿性腦膜炎患兒60例，其中男40例、女20例，年齡0.1～13歲，平均年齡6.5歲，病程3～7 d。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《實(shí)用新生兒學(xué)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)體溫異常，精神差，拒奶，驚厥或有敗血癥的表現(xiàn)；(2)顱內(nèi)壓增高，前囪隆起，骨縫裂開(kāi)，腦膜刺激征陽(yáng)性；(3)腦脊液：白細(xì)胞>20×106/L，葡萄糖降低，蛋白質(zhì)升高；(4)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性或涂片上可見(jiàn)細(xì)菌。符合(1)～(3)條可臨床診斷，具備(4)可確診。所有患兒均確診患有化膿性腦膜炎。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，患兒家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法 根據(jù)患兒的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，使用青霉素、頭孢唑肟等相應(yīng)敏感抗生素治療。對(duì)于病情較重患兒輔以高壓氧治療。根據(jù)患兒實(shí)際情況進(jìn)行電解質(zhì)平衡維持、丙種球蛋白支持以及甘露醇、地塞米松等對(duì)癥治療。

1.3 腦脊液檢測(cè) 抗生素治療<3 d為早期，治療后4 d至2周為后期；如腦脊液常規(guī)、生化2周仍明顯異常者，于抗生素治療4周第3次留取腦脊液做為后期標(biāo)本。分別在抗生素應(yīng)用早期、后期，通過(guò)嚴(yán)格無(wú)菌操作腰椎穿刺獲取組中患兒腦脊液標(biāo)本，每位患兒標(biāo)本分為兩份各2 ml，同時(shí)采用以下兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.1 16S rRNA基因檢測(cè)：應(yīng)用16S rRNA寬范圍PCR擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)化膿性腦膜炎患兒腦脊液標(biāo)本中細(xì)菌基因組 DNA擴(kuò)增，并將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序，明確細(xì)菌菌種。主要試劑與儀器包括：DNA提取試劑(廣州東盛生物科技有限公司)、PCR反應(yīng)試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)、9600型PCR分析儀(美國(guó)ABI公司)。主要步驟如下：(1) 16S rRNA寬范圍PCR擴(kuò)增法：取2 ml腦脊液離心后沉淀以500 μl TE緩沖液懸浮，經(jīng)溶菌酶、蛋白酶K孵育，用酚-氯仿法提取腦脊液中DNA。對(duì)照菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基增菌后取2 ml，通過(guò)以上方法提取腦脊液標(biāo)本中細(xì)菌DNA。采用寬范圍 PCR 擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。每次擴(kuò)增臨床標(biāo)本時(shí)均包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，陰性對(duì)照為PCR體系中不加模板DNA。(2)在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)中應(yīng)用BLAST檢索工具對(duì)所有陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列對(duì)比，從而確立菌名。在GenBank中比對(duì)結(jié)果同源性超過(guò) 98%才能確立為同一種屬。

1.3.2 普通細(xì)菌培養(yǎng)：(1)腦脊液標(biāo)本接種于美國(guó)BacT/ALERT的兒童專用樹(shù)脂培養(yǎng)瓶(美國(guó) bioMerieux公司)中，放置BACTEC 9120全自動(dòng)培養(yǎng)箱(北京普博斯生物科技有限公司)中培養(yǎng)。 (2)陽(yáng)性報(bào)警后移種血、流感嗜血桿菌XV瓊脂平皿，培養(yǎng)18～24 h，分離菌株。(3)采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷和藥敏試驗(yàn)[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果比較 60例化膿性腦膜炎患兒中，腦脊液16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性21例，其中金黃色葡萄球菌4例，大腸埃希菌4例，肺炎鏈球菌3例，無(wú)乳鏈球菌3例，腦膜炎球菌3例，流感嗜血桿菌3例，脆弱擬桿菌1例。腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性9例，其中金黃色葡萄球菌3例，大腸埃希菌2例，腦膜炎球菌2例，流感嗜血桿菌1例，肺炎鏈球菌1例。16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性率為35.0%(21/60)，高于細(xì)菌培養(yǎng)的15.0%(9/60)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.400，P=0.011)。

2.2 抗生素應(yīng)用時(shí)間對(duì)腦脊液細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)及細(xì)菌培養(yǎng)影響 抗生素應(yīng)用早期16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性率略高于抗生素應(yīng)用后期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；抗生素應(yīng)用早期腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率高于抗生素應(yīng)用后期(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同抗生素應(yīng)用時(shí)期兩組檢測(cè)結(jié)果比較(n，%)

3 討 論

小兒化膿性腦膜炎是指由化膿性細(xì)菌感染導(dǎo)致患兒中樞神經(jīng)感染的炎癥。近年來(lái)，抗生素的不規(guī)范使用，導(dǎo)致患兒化膿性腦膜炎早期臨床表現(xiàn)不明顯，腦脊液檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，如不及時(shí)治療會(huì)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)一系列后遺癥，嚴(yán)重者會(huì)有生命危險(xiǎn)[9]。因此，探討小兒化膿性腦膜炎抗生素應(yīng)用時(shí)間對(duì)腦脊液細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)的影響，為小兒化膿性腦膜炎早期確診提供參考，有重要的意義。

16S rRNA基因是細(xì)菌染色體上編碼16S rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物體內(nèi)[10-11]。它具有多拷貝、多信息、長(zhǎng)度適中等特點(diǎn)，集保守性與變異性于一身，既能反映不同菌屬之間的差異，又能利用測(cè)序技術(shù)較容易地得到其序列[8，12]。應(yīng)用16S rRNA寬范圍PCR擴(kuò)增技術(shù)，可在抗生素應(yīng)用早、后期對(duì)化膿性腦膜炎患兒腦脊液中細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序，明確細(xì)菌菌種。而傳統(tǒng)的腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)，由于還沒(méi)有專門(mén)的檢測(cè)儀器完成對(duì)腦脊液自動(dòng)判斷，只能通過(guò)人工鏡像檢測(cè)觀察的方法對(duì)腦脊液細(xì)胞分析，同時(shí)采用生化分析儀完成對(duì)腦脊液中葡萄糖、蛋白質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單分析，這些方法受人為因素影響較大，檢測(cè)可靠性得不到保證[13]。此外，由于患者多為嬰兒，腦脊液總量少，難以足量留取標(biāo)本量以提高培養(yǎng)陽(yáng)性率，亦對(duì)腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)影響較大。本研究結(jié)果顯示，患者中16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性21例(35.0%)，腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性僅9例(15.0%)，16S rRNA基因檢出陽(yáng)性率顯著高于腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)(P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示，抗生素應(yīng)用早期16S rRNA基因檢測(cè)陽(yáng)性率為36.67%，略高于應(yīng)用抗生素后期，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而抗生素應(yīng)用早期腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于應(yīng)用抗生素后期(P<0.05)，提示與腦脊液細(xì)菌培養(yǎng)比較，腦脊液16S rRNA基因檢測(cè)可能更少受抗生素應(yīng)用時(shí)間的影響。這是由于腦脊液細(xì)菌16S rRNA基因檢測(cè)不受腦脊液中細(xì)菌增殖分裂的影響，即使腦脊液中細(xì)菌濃度較低，也能獲得較好的檢測(cè)結(jié)果。這表明即使在服用抗生素治療后期，腦脊液16S rRNA基因檢測(cè)亦能得到準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，為停用抗生素提供有力判斷依據(jù)，避免抗生素的濫用及病情的遷延與反復(fù)。

綜上所述，在抗生素治療化膿性腦膜炎患兒中，進(jìn)行腦脊液16S rRNA基因檢測(cè)較傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法具有較高的陽(yáng)性率，且在抗生素應(yīng)用早期及后期的檢出陽(yáng)性率差異不大。這有助于提高對(duì)化膿性腦膜炎患兒的早期診斷能力，并為臨床醫(yī)師及時(shí)、合理地使用抗生素治療提供依據(jù)。

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Application value of cerebrospinal fluid bacterial 16S ribosomal RNA gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy

ZHENGKe-lu,YANGSi-da,GAOYuan-yuan,CHENWen-xiong,HUANGYi-ling,ZHANGYa-ni

(DepartmentofPediatricNeurology,GuangzhouWomenandChildrenMedicalCenter,Guangzhou510623,China)

Objective To investigate the application value of cerebrospinal fluid(CSF) bacterial 16S ribosomal RNA(16S rRNA) gene detection in children with purulent meningitis after antibiotic therapy.Methods Sixty children with purulent meningitis were enrolled.The CSF specimens were collected during the early and late stages of antibiotic therapy,and used for 16S rRNA gene detection and at the bacterial culture.The detection positive rates were compared between the two methods,and the effect of antibiotic application time on the results of the two methods was analyzed.Results Twenty-one(35.0%) and 9(15.0%) positive cases were observed in CSF 16S rRNA gene detection and CSF bacterial culture respectively.The detection positive rate of 16S rRNA gene detection was higher than that of bacterial culture(P<0.05).For 16S rRNA gene detection,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was higher than that during the late stage,but no statistical difference was observed(P>0.05).For CSF bacterial culture,the detection positive rate during the early stage of antibiotic therapy was significantly higher than that during the late stage(P<0.05).Conclusion For the children with purulent meningitis after antibiotic therapy,the detection positive rate of CSF 16S rRNA gene detection is higher and is less affected by the application time of antibiotics compared to the rate of CSF bacterial culture.

Purulent meningitis,Antibiotics,Cerebrospinal fluid,16S ribosomal RNA,Bacterial culture,Gene detection

廣東省廣州市衛(wèi)生局課題(20151A010050)

鄭可魯(1979～)，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)內(nèi)科。

R 512.3

A

0253-4304(2016)10-1367-03

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.10.08

2016-05-15

2016-07-18)