結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用

藺景雙，藺晨，郝興亮，馮濤，王世壽

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營257034)

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用

藺景雙，藺晨，郝興亮，馮濤，王世壽

(勝利油田中心醫(yī)院，山東東營257034)

目的 探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)診斷肺結(jié)核的臨床價值。方法選擇疑似肺結(jié)核患者324例，均行全血T-SPOT.TB及結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)，血清結(jié)核桿菌抗體(TB-AB)、痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)結(jié)核分枝桿菌檢測，42例行肺組織病理學(xué)檢查。臨床確診肺結(jié)核164例，均給予常規(guī)抗結(jié)核治療，T-SPOT.TB陽性患者每隔30天復(fù)查1次T-SPOT.TB。比較各方法診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性，觀察T-SPOT.TB陽性患者隨訪30、60、90、120天時T-SPOT.TB陽性率變化。結(jié)果T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感性為95.1%，均高于其他方法(P均<0.05)；T-SPOT.TB、痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測、BALF結(jié)核分枝桿菌檢測、肺組織病理診斷特異性分別為91.3%、100%、100%、100%，明顯高于PPD試驗(yàn)、血清TB-AB(P均<0.05)。T-SPOT.TB陽性患者127例，隨訪第30、60、90、120天時T-SPOT.TB陽性率分別為83.5%(106/127)、67.7%(86/127)、35.4%(45/127)、10.2%(13/127)。結(jié)論T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核具有較高的敏感性及特異性。

肺結(jié)核；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；結(jié)核桿菌；診斷

近幾年來我國肺結(jié)核發(fā)病率呈明顯上升趨勢。目前肺結(jié)核診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)核菌素(PPD)試驗(yàn)、血清結(jié)核桿菌抗體(TB-AB)、痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測以及支氣管肺泡灌洗液(BALF)結(jié)核分枝桿菌檢測等，但上述方法在檢測時間及特異性、敏感性等方面均存在不足[1～4]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是一種快速檢測結(jié)核分枝桿菌感染的方法，近年來逐漸用于肺結(jié)核的診斷。本研究對324例疑似肺結(jié)核患者行T-SPOT.TB，并與其他實(shí)驗(yàn)室檢查方法的診斷結(jié)果進(jìn)行比較，探討T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年10月勝利油田中心醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者324例，男211例、女113例，年齡16～76歲、中位年齡53歲，其中呼吸內(nèi)科209例、心內(nèi)科14例、保健科26例、消化內(nèi)科10例、風(fēng)濕科65例，均有典型的肺結(jié)核臨床表現(xiàn)及影像學(xué)特點(diǎn)，排除人免疫缺陷病毒(HIV)感染及應(yīng)用免疫抑制劑(抗腫瘤化療藥及糖皮質(zhì)激素)者。

1.2 肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷方法 324例患者均行全血T-SPOT.TB及PPD試驗(yàn)，血清TB-AB、痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測以及BALF結(jié)核分枝桿菌檢測；42例行肺組織病理學(xué)檢查。具體方法：①全血T-SPOT.TB：抽取靜脈血4 mL，給予肝素抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，得到外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)；將PBMCs與結(jié)核特異抗原早期分泌靶抗原6(ESAT-6)和培養(yǎng)分泌蛋白10(CFP-10)分別加入預(yù)包被抗γ-干擾素(γ-INF)抗體的反應(yīng)孔中，孵育過夜；PBS洗滌，加入二抗，第二次洗滌后加入底物顯色，計(jì)數(shù)顯色斑點(diǎn)數(shù)。如空白對照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6個，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)-空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)<6個，判定為陽性；如空白對照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)≥6個，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)的2倍，亦判定為陽性；其余結(jié)果為陰性。T-SPOT.TB試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。② PPD試驗(yàn)：將5 IU卡介苗純蛋白衍生物稀釋劑注入前臂掌側(cè)皮內(nèi)，注射后72 h觀察結(jié)果，測量硬結(jié)直徑。硬結(jié)直徑<5 mm為陰性，5～9 mm為陽性，10～14 mm為中度陽性，15～19 mm或>20 mm或有水泡、壞死為強(qiáng)陽性。③血清TB-AB檢測：應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒(膠體金法)，步驟參照試劑盒說明書。測試結(jié)果在5～10 min內(nèi)讀取,出現(xiàn)兩條紫紅色條帶為陽性，僅質(zhì)控區(qū)(c)出現(xiàn)一條紫紅色條帶為陰性。④痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測：采用萋尼染色法，取新鮮痰液涂片，抗酸染色，首先鏡檢找到可能抗酸性桿菌，再進(jìn)一步鑒定。⑤ BALF結(jié)核分枝桿菌檢測：選擇病變肺段進(jìn)行灌洗，經(jīng)支氣管鏡活檢孔通過一細(xì)硅膠管注入利多卡因2 mL，進(jìn)行灌洗肺段局部麻醉，再經(jīng)硅膠管注入常溫生理鹽水，總量100～200 mL，分3～5次序貫灌入。每次灌入一份生理鹽水后，負(fù)壓吸出BALF。灌洗液涂片鏡檢查找結(jié)核桿菌。⑥肺組織病理學(xué)檢查：經(jīng)支氣管鏡對肺內(nèi)病灶鉗取活組織進(jìn)行病原學(xué)及病理學(xué)檢查，抗酸染色發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌，組織表現(xiàn)為滲出型病變、增殖型病變、干酪樣壞死。

1.3 肺結(jié)核的臨床診斷 ①菌陽肺結(jié)核根據(jù)衛(wèi)生部《WS288-2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[1]。確診菌陽肺結(jié)核12例，男8例、女4例，年齡52～76歲。②參照2001年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會制定的菌陰肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，診斷菌陰肺結(jié)核152例，男83例、女69例，年齡16～73歲。③參照文獻(xiàn)[1]標(biāo)準(zhǔn)確診活動性肺結(jié)核12例，男8例、女4例，年齡52～76歲。④臨床診斷活動性肺結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)：符合典型結(jié)核病臨床及影像學(xué)表現(xiàn)，但未獲得病原學(xué)及病理學(xué)證實(shí)，疑似結(jié)核病患者經(jīng)診斷性抗結(jié)核治療或隨訪觀察，臨床可排除其他非結(jié)核性疾病。臨床診斷活動性肺結(jié)核152例，男94例、女58例，年齡16～73歲。肺結(jié)核確診患者均給予常規(guī)抗結(jié)核治療，其中T-SPOT.TB陽性者每隔30天復(fù)查T-SPOT.TB。比較各診斷方法確診肺結(jié)核的例數(shù)，計(jì)算診斷敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率，觀察T-SPOT.TB陽性患者隨訪30、60、90、120天時T-SPOT.TB陽性率變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

324例疑診肺結(jié)核患者中臨床確診肺結(jié)核164例，其中臨床診斷活動性肺結(jié)核152例、確診活動性肺結(jié)核12例，各診斷方法確診肺結(jié)核例數(shù)見表1。T-SPOT.TB 的診斷敏感性為95.1%，均明顯高于其他方法(P均<0.05)；T-SPOT.TB、痰涂片診斷特異性分別為91.3%、100%，均明顯高于其他方法(P均<0.05)；見表2。8例T-SPOT.TB假陰性患者均為60歲以上老年人，且多伴有2型糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、慢性腎功能不全等基礎(chǔ)疾病。162例T-SPOT.TB陽性者中127例堅(jiān)持復(fù)查120天，30、60、90、120天時T-SPOT.TB陽性率分別為83.5%(106/127)、67.7%(86/127)、35.4%(45/127)、10.2%(13/127)。

表1 各診斷方法確診肺結(jié)核例數(shù)(例)

注：42例行組織病理檢查。

表2 各診斷方法檢查結(jié)果比較(%)

注：與T-SPOT.TB比較，*P<0.05。

3 討論

目前肺結(jié)核診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、TB-AB、細(xì)菌學(xué)檢查等進(jìn)行綜合判斷[3]。PPD、TB-AB、痰涂片等是目前診斷肺結(jié)核常用的方法，這些方法雖然能夠做到快速檢測，但在特異性和敏感性方面存在不足[4]。我國人口出生后均要接種卡介苗，而卡介苗接種與PPD試驗(yàn)存在交叉反應(yīng)[5]，且易導(dǎo)致TB-AB檢測陽性率、敏感性、特異性下降；痰涂片找結(jié)核菌雖特異性很高，但陽性率低，主要為患者留痰方法不當(dāng)、留痰標(biāo)本不合格所致。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)是診斷肺結(jié)核的可靠方法，但所需時間較長，不能及時診斷[6]。

機(jī)體感染結(jié)核桿菌后產(chǎn)生特異效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，致敏T淋巴細(xì)胞再次受結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激時，可活化分泌釋放γ-INF。檢測機(jī)體γ-INF水平和(或)計(jì)數(shù)分泌γ-INF的T淋巴細(xì)胞，可了解機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后的免疫應(yīng)答狀態(tài)，輔助診斷結(jié)核病。T-SPOT.TB是一種計(jì)數(shù)單個結(jié)核特異的效應(yīng)T細(xì)胞的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)檢測方法，可計(jì)錄每個活化的結(jié)核特異效應(yīng)T細(xì)胞，其檢測原理是以ESAT-6和CFP-10結(jié)核分枝桿菌特有的基因序列作為刺激抗原，刺激外周血單個核細(xì)胞；若機(jī)體存在結(jié)核感染的特異效應(yīng)T細(xì)胞，經(jīng)刺激抗原刺激后會產(chǎn)生大量γ-INF，通過ELISPOT技術(shù)可間接測定特異的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量，以此判斷機(jī)體存在結(jié)核感染[7]。T-SPOT.TB能準(zhǔn)確判斷是否存在結(jié)核桿菌感染，敏感性及特異性較高[8]。本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB臨床確診肺結(jié)核的敏感性為95.1%，與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果(81.1%～98.4%)一致[9～12]。非肺結(jié)核患者T-SPOT.TB檢測特異性為91.3%，國內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果為65.5%～92.1%[11～14]，數(shù)值波動范圍較大，有待于大樣本研究以驗(yàn)證該結(jié)果。本研究中PPD、血清TB-AB、痰涂片結(jié)核分枝桿菌、BALF結(jié)核分枝桿菌、肺組織病理檢測的敏感性均明顯低于T-SPOT.TB，且假陰性率均明顯高于T-SPOT.TB，PPD、血清TB-AB假陽性率也明顯高于T-SPOT.TB；痰涂片結(jié)核分枝桿菌、BALF結(jié)核分枝桿菌、肺組織病理檢測的特異性與T-SPOT.TB檢查結(jié)果比較無明顯差異，但其敏感性較低，假陰性率較高；PPD、血清TB-AB的特異性均明顯低于T-SPOT.TB。以上研究結(jié)果提示T-SPOT.TB在診斷肺結(jié)核方面較其他檢測方法有明顯的優(yōu)勢。另外，本研究結(jié)果顯示經(jīng)抗結(jié)核治療后T-SPOT.TB陽性患者逐漸轉(zhuǎn)陰，其轉(zhuǎn)陰速度與臨床癥狀轉(zhuǎn)變趨勢一致，提示可根據(jù)T-SPOT.TB是否轉(zhuǎn)陰判斷抗結(jié)核治療效果。

本研究中T-SPOT.TB假陽性率為8.8%，假陰性率為4.9%。8例假陰性患者均患有慢性疾病，且為老年患者，其本身免疫功能降低，抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能，影響T-SPOT.TB的檢查結(jié)果。T-SPOT.TB試劑盒在診斷活動性肺結(jié)核方面仍值得探討，該方法目前只能用于檢測是否存在結(jié)核感染，并不能鑒別活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染[15,16]。如果臨床上考慮患者為陳舊性肺結(jié)核，而T-SPOT.TB陽性，是否給患者抗結(jié)核治療仍值得探討。

綜上所述，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核具有較高的敏感性及特異性，且假陽性率及假陰性率低。

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