乳鐵蛋白調控炎癥反應中NF-κB表達的分子機制研究進展

陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學華西口腔醫學院，成都610041)

乳鐵蛋白調控炎癥反應中NF-κB表達的分子機制研究進展

陳柳菁，李娟，孟姝

(四川大學華西口腔醫學院，成都610041)

乳鐵蛋白是一種天然的免疫調節蛋白，而NF-κB在細胞增殖、分化、免疫調節和炎癥反應等過程中具有重要作用。乳鐵蛋白與NF-κB在結構與功能上密切相關，其在炎癥反應中對NF-κB具有重要的調控作用；在機體的不同疾病狀態和炎癥反應的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白呈現出不同的效應。

乳鐵蛋白；核轉錄因子kappa B；炎癥

乳鐵蛋白是在多個種族之間具有高度同源性的多功能糖基化蛋白[1]，具有抗微生物、激活免疫細胞、抑制炎性因子、抑制嗜酸性粒細胞增殖、清除自由基、抑制癌細胞生長等功能[2, 3]。NF-κB是一種重要的快反應核轉錄因子[4]，在炎癥反應中發揮重要作用；NF-κB信號通路又是與炎癥級聯反應關系最為密切的信號通路，以NF-κB為節點，多條信號通路相互溝通交聯。基因層面上，乳鐵蛋白DNA上具有兩個位點，可能通過與NF-κB基因二聚轉錄因子REL同源區(RHDs)靶點結合而實施對NF-κB的調控[5, 6]；分子層面上，乳鐵蛋白的碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]是調控NF-κB表達的重要結構。乳鐵蛋白對炎癥反應的干預與其對NF-κB的調控作用密不可分。本研究對炎癥反應中乳鐵蛋白調控NF-κB表達的分子機制研究進展綜述如下。

1 乳鐵蛋白在結構和功能上與NF-κB的聯系

1.1 乳鐵蛋白調控NF-κB有關的基因位點 當G-菌侵入機體時，乳鐵蛋白通過與G-菌的脂多糖(LPS)相互作用調控NF-κB的表達。Pauciullo等[6]發現，山羊乳鐵蛋白啟動子區包含了3個可能與LPS結合相關的元件，其中2個是與調控NF-κB表達有關的位點，即-960/-949和-852/-838。這兩個位點所屬區域在人、牛、豬、鼠、駱駝等物種中均具有高度保守性，說明其在乳鐵蛋白對NF-κB基因層面的調節中起到了關鍵作用。Gilmore等[5]則認為，乳鐵蛋白基因啟動子和增強子區的κB位點(50-GGGRNNYYCC-30，N為任意核苷酸)能與NF-κB基因二聚轉錄因子REL同源區(RHDs)結合，從而實施對NF-κB的調控。

1.2 乳鐵蛋白調控NF-κB相關的結構 乳鐵蛋白是一種糖蛋白，糖基共價結合在Asn-XThr/Ser(X為任意氨基酸)的天冬酰胺殘基上，形成2～4條N-連接型碳水化合物鏈。該碳水化合物鏈經分離、純化后可促進鼠成纖維細胞NF-κB RelA:p50的活化；同時，在THP-1細胞系的實驗中也表明，當人乳鐵蛋白的碳水化合物鏈被水解成寡肽甚至氨基酸時是無法誘導NF-κB活化的[9]。上述研究表明，碳水化合物鏈在人乳鐵蛋白誘導NF-κB活化方面不可或缺[7]。乳鐵蛋白多肽鏈N端肽段也為乳鐵蛋白功能的發揮提供了基礎。Ando等[7]研究發現，乳鐵蛋白可以削弱THP-1細胞株中LPS誘導NF-κB活化的能力，與乳鐵蛋白上能與LPS結合的某一多肽段相關。Xin等[8]研究發現，豬乳鐵蛋白N端肽段LFP-20能抑制IKK-β的磷酸化，使IκB-α和NF-κB(p65)的磷酸化減少，從而抑制NF-κB(p65)的活化。

2 乳鐵蛋白對炎癥反應中NF-κB表達的調控作用

靜息狀態下，NF-κB與抑制單位IκB的中心區結合，以NF-κB-IκB復合體的無活性形式存在于細胞質中。盡管許多因素都能活化NF-κB，但所有通路都擁有一個核心調控子，即IKK復合物。IKK復合物由2個催化亞單位(IKKα、IKKβ)及1個調控亞單位IKKγ(NF-κB的基本調節子，也稱為NEMO)組成[10]，IKKβ的活化能使IκBα磷酸化，隨后被K48(或K63)多聚泛素化和蛋白酶降解，使NF-κB脫離IκB的束縛而進入細胞核中，與DNA結合，啟動下游靶基因的表達，發揮免疫調節作用[11]。也有報道顯示，NF-κB的活化依賴于自身第536位氨基酸Ser536的磷酸化，與IκBα無關[12]。乳鐵蛋白既參與固有免疫，又參與適應性免疫，不僅可幫助宿主抵抗微生物入侵，也使宿主免于遭受炎癥的破壞性效應。但是在機體不同的疾病狀態和炎癥反應的不同階段，不同物種的乳鐵蛋白表現出不同的效應，即乳鐵蛋白既有抗炎作用，又有促炎作用。乳鐵蛋白對NF-κB的調控大多數情況下表現為抑制，但也可表現為促進。

2.1 下調NF-κB表達 研究表明，在2.5%硫酸葡聚糖鈉(DSS)誘導的小鼠腸炎模型中，牛乳鐵蛋白能減少NF-κB的表達，緩解小鼠炎癥表現[13]。van der Does等[14]研究表明，hLF1-11(由人乳鐵蛋白N端頭11個氨基酸組成)能降低單核細胞中NF-κB(p65)的表達。此外，乳鐵蛋白能減少2型糖尿病小鼠模型中LPS誘導的TNF-α、IL-6和IL-1表達[15]，其機制與競爭性結合相關細胞因子啟動子區 NF-κB位點有關[16]。研究表明，在人K562和Caco-2細胞核中的ICAM-1啟動子區域，LF作用位點和NF-κB作用位點存在一定交叉[17]。外源性乳鐵蛋白(LF)可以轉移到細胞核內，競爭性結合ICAM-1啟動子上與NF-κB位點重疊的LF位點，從而抑制TNF-α誘導的內皮細胞ICAM-1等炎性因子的生成[18]。乳鐵蛋白下調NF-κB的作用主要通過MyD88途徑和TRAF6途徑實現。

2.1.1 MyD88途徑 生理情況下，TLR4被激活后，MyD88可在橋接配體TIRAP的介導下與TLR4結合；也能借助雙方蛋白結構中的死亡域、激酶與IRAK4結合。IRAK4相關受體隨后使IRAK1磷酸化，磷酸化的IRAK1則能與E3泛素化連接酶TRAF6形成復合物[19]，在包含UBC13和UEV1A的E2復合物的輔助下，引起由K63介導的TRAF6多聚泛素化，并通過TAB2和TAB3泛素結合蛋白招募TAK1[20]。TAK1是一種IKK激酶，能磷酸化IKKβ活化鏈中關鍵性的絲氨酸，從而使IKKβ活化，隨后磷酸化，并經歷IκBα K48基團多聚泛素化的過程，最終導致IκBα降解，激活NF-κB[21]。Xin等[8]研究表明，LPS能上調豬肺泡巨噬細胞MyD88表達，而豬乳鐵蛋白活性肽段(LFP-20)則抑制MyD88表達。采用siRNA技術干擾巨噬細胞中MyD88的表達后，LFP-20則無法抑制IKK-β的磷酸化，也不能下調NF-κB的表達。因此推測LFP-20是通過下調活化的巨噬細胞中與MyD88相互作用的信號分子而影響MyD88表達，如抑制MyD88上游分子TLR4等。LFP-20能抑制豬肺泡巨噬細胞中LPS所誘導的TLR4表達，主要是通過削弱LFP-20對LPS的細胞外結合來實現的[8]，但LFP-20能否抑制LPS與TLR4的結合活性目前尚無研究證實。此外，LFP-20也能通過MyD88抑制MAPK信號通路間接實現對NF-κB的調節，并影響炎癥反應中的相關細胞因子的基因轉錄[22]。

2.1.2 TRAF6途徑 Toshihiro等[18]研究表明，牛乳鐵蛋白可下調LPS介導的NF-κB表達，其作用靶點不在MyD88，而在MyD88甚至IRAK1的下游；這些下游信號通過特異性結合TLR4受體的結構域來阻斷TLR4的信號轉導，并抑制IRAKI的降解；而當選擇性抑制IKKβ時，則不能抑制IRAKI的降解。因此，IRAK1的降解需要IRAK1激酶的作用和自動磷酸化作用，說明牛乳鐵蛋白的調控靶點位于IRAK1的下游。研究表明，牛乳鐵蛋白是通過干擾TNF受體相關因子(TRAF6)的多聚泛素化來影響NF-κB活化的，且具有時間依賴性；LPS能明顯引起小鼠間充質干細胞ST2細胞株TRAF6 Lys-63相關的泛素化，而預先用牛乳鐵蛋白處理過的LPS則沒有這種作用，TRAF6-TAK1復合物的形成也受到抑制，無法使IKK激活[23]。分析原因，可能是牛乳鐵蛋白直接與ST2細胞株中的內源性TRAF6結合，從而阻斷NF-κB的活化。但Oh等[24]研究表明，乳鐵蛋白可通過上調TRAF6而促進NF-κB的表達；其機制可能是乳鐵蛋白通過與TRAF6的環指或鋅指區域結合，進而招募IKK復合物，最終使NF-κB(p65)磷酸化活性增強。

2.2 上調NF-κB表達 雖然大多數研究顯示乳鐵蛋白具有優良的抗炎特性，能抑制NF-κB的表達，但也有研究報道，乳鐵蛋白可上調NF-κB的表達[7]。Ando等[7]研究表明，人乳鐵蛋白在25～500 μg/mL(遠低于生理濃度)時，可以不依賴于LPS或其經典的活化因子(如TNF或IL-1)，便能激活THP-1細胞株NF-κB的表達，與前述乳鐵蛋白可下調NF-κB表達的結論不符。Ando等[7]認為，乳鐵蛋白糖基化后與CD14形成LF-CD14復合物，一方面的確能干擾CD14-LPS復合物的形成，從而減弱LPS信號轉導，下調NF-κB的表達；另一方面又能通過碳水化合物鏈激活TLR4，通過MyD88依賴和非依賴途徑活化NF-κB。由MyD88介導的LF對NF-κB的活化過程，與生理調節過程相似；而在MyD88非依賴途徑中，LF可通過TRIF來活化NF-κB。當TLR4激活TRIF后，TRIF可通過N端的TRAF6結合相關基序直接與TRAF6結合，其C端包含Rip同源基序，可與RIP1結合[25]。與MyD88依賴途徑類似，TRAF6可活化TAK1，RIP1可通過多聚泛素化與TRAF6、TAK1形成復合物，導致NF-κB的活化[26]。但實際上，在TLR4介導LF對NF-κB的調節過程中，是先通過MyD88依賴途徑，再通過TRIF途徑而實現的[7]。

關于何種情況下乳鐵蛋白上調和下調NF-κB表達的作用更為突出，可能與乳鐵蛋白的濃度有關。研究表明，低濃度牛乳鐵蛋白(0.1～1 g/L)能阻斷NF-κB活化，進而減少IL-8分泌，顯示出抗炎效應；而高濃度乳鐵蛋白(10 g/L)則表現出促炎效應，上調NF-κB的表達[27]。有研究采用0.1、1、10 g/L的牛乳鐵蛋白分別處理豬腸上皮細胞，發現當牛乳鐵蛋白濃度為0.1 g/L時，NF-κB的表達基本不變；濃度為1～10 g/L時才會導致NF-κB活化，且10 g/L牛乳鐵蛋白的激活速度要快于1 g/L[28, 29]。由此說明，乳鐵蛋白上調或下調NF-κB的表達是具有濃度依賴效應的。此外，乳鐵蛋白上調和下調NF-κB表達的作用也可能與其亞結構、細胞特性及生理狀況有關。乳鐵蛋白具有不同的亞結構，如碳水化合物鏈[7]和N端肽段[8]，可能對NF-κB的表達具有不同的調節效應。而不同類型的細胞，因其生物學特性和生理情況不同，對乳鐵蛋白的作用也呈現出不同的反應。關于不同生理情況下何種亞結構對NF-κB表達的調節占主導地位，亟待研究。

綜上所述，乳鐵蛋白和NF-κB在結構和功能上密切相關。以NF-κB為節點，多種不同的信號通路相互溝通交聯，不同物種、不同濃度的乳鐵蛋白作用于不同的細胞，可通過不同的通路上調或下調NF-κB表達。關于乳鐵蛋白對NF-κB的促進和抑制作用分別在何種情況下占主導地位以及深層次的調控機制仍有待于進一步研究。

[1] Chatterton DE, Nguyen DN, Bering SB, et al. Anti-inflammatory mechanisms of bioactive milk proteins in the intestine of newborns[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2013,45(8):1730-1747.

[2] Cooper C, Nonnecke E, Bo L, et al. The lactoferrin receptor may mediate the reduction of eosinophils in the duodenum of pigs consuming milk containing recombinant human lactoferrin[J]. Biometals, 2014,27(5):1031-1038.

[3] Valenti P, Vogel HJ. Lactoferrin, all roads lead to Rome[J]. Biometals, 2014,27(5):803-806.

[4] Muzio M, Polentarutti N, Bosisio D, et al. Toll-like receptor family and signalling pathway[J]. Biochem Soc Trans, 2000,28(5):563-566.

[5] Gilmore TD. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives[J]. Oncogene, 2006,25(51):6680-6684.

[6] Pauciullo A, Cosenza G, Nicodemo D, et al. Molecular cloning, promoter analysis and SNP identification of Italian Nicastrese and Saanen lactoferrin gene[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2010,134(3-4):279-283.

[7] Ando K, Hasegawa K, Shindo KI, et al. Human lactoferrin activates NF-κB through the Toll-like receptor 4 pathway while it interferes with the lipopolysaccharide-stimulated TLR4 signaling[J]. FEBS J, 2010,277(9):2051-2066.

[8] Xin Z, Song D, Wang T, et al. LFP-20, a porcine lactoferrin peptide, ameliorates LPS-induced inflammation via the MyD88/NF-κB and MyD88/MAPK signaling pathways[J]. Dev Comp Immunol, 2015,52(2):123-31.

[9] Baker EN, Baker HM. A structural framework for understanding the multifunctional character of lactoferrin[J]. Biochimie, 2009,91(1):3-10.

[10] Schmukle AC, Henning W. No one can whistle a symphony alone-how different ubiquitin linkages cooperate to orchestrate NF-κB activity[J]. J Cell Sci, 2012,125(Pt3):549-559.

[11] Shirane M, Hatakeyama SK, Nakayama K, et al. Common pathway for the ubiquitination of IkappaBalpha, IkappaBbeta, and IkappaBepsilon mediated by the F-box protein FWD1[J]. J Biol Chem, 1999,274(40):28169-28174.

[12] Doyle SL, Jefferies CA, O′neill LA. Bruton′s tyrosine kinase is involved in p65-mediated transactivation and phosphorylation of p65 on serine 536 during NFkappaB activation by lipopolysaccharide[J]. J Biol Chem, 2005,280(25):23496-23501.

[13] Spagnuolo PA, Hoffman-Goetz L. Dietary lactoferrin does not prevent dextran sulfate sodium induced murine intestinal lymphocyte death[J]. Exper Biol Med, 2008,233(9):1099-1108.

[14] van der Does AM, Bogaards SJ, Jonk L, et al. The human lactoferrin-derived peptide hLF1-11 primes monocytes for an enhanced TLR-mediated immune response[J]. Biometals, 2010,23(3):493-505.

[15] Moreno-Navarrete JM, Ortega FJ, Bassols J, et al. Decreased circulating lactoferrin in insulin resistance and altered glucose tolerance as a possible marker of neutrophil dysfunction in type 2 diabetes[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009,94(10):4036-4044.

[16] Gong XW, Xu YJ, Yang QH, et al. Effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on the IKKβ-NF-κB signaling pathway in kupffer cells of nonalcoholic steatohepatitis rats[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015,2015:687-690.

[17] Sun L, Deng L, Ea CK, et al. The TRAF6 ubiquitin ligase and TAK1 kinase mediate IKK activation by BCL10 and MALT1 in T lymphocytes[J]. Mol Cell, 2004,14(3):289-301.

[18] Toshihiro I, Aki K, Mutsumi M, et al. Molecular mechanisms of the inhibitory effects of bovine lactoferrin on lipopolysaccharide-mediated osteoclastogenesis[J]. J Biol Chem, 2012,287(28):23527-23536.

[19] Carmody RJ. Nuclear factor-κB: activation and regulation during Toll-Like receptor signaling[J]. Cell Mol Immunol, 2007,4(1):31-41.

[20] Deng L, Wang C, Spencer E, et al. Activation of the IkappaB kinase complex by TRAF6 requires a dimeric ubiquitin-conjugating enzyme complex and a unique polyubiquitin chain[J]. Cell, 2000,103(2):351-361.

[21] Ruaidhri, Carmody, Youhai, et al. Nuclear Factor-kB: activation and regulation during Toll-Like receptor signaling[J]. Cell Mol Immunol, 2007,4(2):31-41.

[22] Diao Y, Xin Y, Zhou Y, et al. Extracellular polysaccharide from Bacillus sp. strain LBP32 prevents LPS-induced inflammation in RAW 264.7 macrophages by inhibiting NF-κB and MAPKs activation and ROS production[J]. Int Immunopharmacol, 2014,18(1):12-19.

[23] Inubushi T, Kawazoe A, Miyauchi M, et al. Molecular mechanisms of the inhibitory effects of bovine lactoferrin on lipopolysaccharide-mediated osteoclastogenesis[J]. J Biol Chem, 2012,287(28):23527-23536.

[24] Oh SM, Lee SH, Lee BJ, et al. A distinct role of neutrophil lactoferrin in RelA/p65 phosphorylation on Ser536 by recruiting TNF receptor-associated factors to IkappaB kinase signaling complex[J]. J Immunol, 2007,179(9):5686-5692.

[25] Akira S. TLR Signaling[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2006,311(5):1-16.

[26] Inomata M, Niida S, Shibata KI, et al. Regulation of Toll-like receptor signaling by NDP52-mediated selective autophagy is normally inactivated by A20[J]. Cell Mol Life Sci, 2012,69(6):963-979.

[27] Nguyen DN, Li Y, Sangild PT. Effects of bovine lactoferrin on the immature porcine intestine[J]. Br J Nutr, 2014,111(2):321-331.

[28] Nguyen DN, Li Y, Sangild PT, et al. Effects of bovine lactoferrin on the immature porcine intestine[J]. Br J Nutr, 2014,111(2):321-331.

[29] Samuli R, Lei L, N Nanda N, et al. TGF-β2induces maturation of immature human intestinal epithelial cells and inhibits inflammatory cytokine responses induced via the NF-κB pathway[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2011,54(5):630-638.

國家大學生創新訓練計劃項目(201510610114)；四川省科技支撐計劃生物骨材料開發關鍵技術研究項目(2014SZ0019)。

孟姝(E-mail： dreamingsue@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.037

R341

A

1002-266X(2016)48-0106-04

2016-06-04)