骨肉瘤組織miR-133b表達(dá)變化及意義

林琰杰，于嘉智，魏傳銀

(1淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200；2濟(jì)南市兒童醫(yī)院)

骨肉瘤組織miR-133b表達(dá)變化及意義

林琰杰1，于嘉智2，魏傳銀1

(1淄博市第一醫(yī)院，山東淄博255200；2濟(jì)南市兒童醫(yī)院)

目的 探討微小RNA-133b(miR-133b)在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法收集32例行骨肉瘤切除術(shù)患者的骨肉瘤組織及肉瘤旁正常骨組織(簡(jiǎn)稱(chēng)正常骨組織)，采用熒光定量PCR法檢測(cè)其miR-133b、miR-451、miR-15a、miR-646、miR-218、miR-449a相對(duì)表達(dá)量，Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白(p21、p27、PCNA、Ki67)和Krppel樣因子4(KLF-4)蛋白相對(duì)表達(dá)量。采用Spearman相關(guān)分析法分析骨肉瘤組織中miR-133b與KLF4表達(dá)之間的關(guān)系。結(jié)果骨肉瘤組織miR-133b相對(duì)表達(dá)量低于正常骨組織(P<0.01)；兩種組織miR-451、miR-15a、miR-646、miR-218、miR-449a相對(duì)表達(dá)量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。骨肉瘤組織p21、p27蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常骨組織，PCNA、Ki67、KLF-4蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常骨組織(P均<0.01)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中miR-133b與KLF-4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.344，P<0.01)。結(jié)論骨肉瘤組織miR-133b表達(dá)降低； miR-133b可能通過(guò)下調(diào)KLF-4表達(dá)而參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。

骨肉瘤；微小RNA-133b；Kruppel樣因子4；細(xì)胞增殖

骨肉瘤是兒童和青少年常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，具有轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、生存率低等特點(diǎn)。雖然近幾年輔助化療和新輔助化療的應(yīng)用大大提高了患者的生存率，但是現(xiàn)有化療藥物的毒副作用使許多患者無(wú)法堅(jiān)持化療，最終發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)。因此，尋求一種有效的抗骨肉瘤細(xì)胞增殖的靶向藥物對(duì)于改善患者預(yù)后具有重要意義。研究證實(shí)，微小RNA(miRNAs)對(duì)離體骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲具有重要的調(diào)控作用[1]，其中研究較多的miRNAs包括miR-133b、miR-451、miR-15a、miR-646、miR-218、miR-449a[2～7]。但是目前為止，這6種miRNAs在骨肉瘤領(lǐng)域的研究都局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在人體骨肉瘤組織中的表達(dá)情況及其作用機(jī)制尚未闡明。為此，我們于2013年1月～2015年12月進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇淄博市第一醫(yī)院行骨肉瘤切除術(shù)患者的骨肉瘤組織及肉瘤旁正常骨組織(簡(jiǎn)稱(chēng)正常骨組織)各32例份，均經(jīng)病理證實(shí)。患者男20例、女12例，年齡12～43(23.0±4.6)歲。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，患者及其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 組織miRNAs檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取骨肉瘤組織及正常骨組織，研磨后加入裂解液，TRIzol試劑提取組織中的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：16 ℃、30 min，45 ℃、30 min，85 ℃、5 min。采用SYBR Green熒光定量PCR法檢測(cè)miR-133b、miR-451、miR-15a、miR-646、miR-218、miR-449a表達(dá)，引物序列均由上海吉?jiǎng)P生物公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、15 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)40次；最后72 ℃延伸8 min。每組樣品重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算上述miRNAs相對(duì)表達(dá)量。

1.3 組織中增殖相關(guān)蛋白及Kruppel樣因子4(KLF-4)表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取骨肉瘤組織及正常骨組織，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，每孔加入30 μL樣品，70 V、30 min進(jìn)行蛋白濃縮，100 V、2 h進(jìn)行蛋白電泳。用孔徑為0.45 μm的PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，常溫下TBST洗膜3次、封閉1 h，分別加入兔(鼠)抗人p21一抗(或抗p27、PCNA、Ki67、KLF-4、GAPDH一抗，工作液濃度均為1∶1 000，英國(guó)Abcam公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。常溫下TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔(鼠)二抗(美國(guó)Jackson公司)，孵育后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光。柯達(dá)膠片暗室顯影，采用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，采用目的蛋白與GAPDH灰度值的比值計(jì)算其蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤組織及正常骨組織miRNAs表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

表1 骨肉瘤組織及正常骨組織miRNAs相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常骨組織比較，*P<0.01。

2.2 骨肉瘤組織及正常骨組織細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及KLF-4蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2。

表2 骨肉瘤組織及正常骨組織細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白及KLF-4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與正常骨組織比較，*P<0.01。

2.3 骨肉瘤組織miR-133b與KLF-4表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中miR-133b與KLF-4表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.344，P<0.01)。

3 討論

惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征是增殖和轉(zhuǎn)移，不僅與腫瘤細(xì)胞的侵襲性增強(qiáng)、黏附能力下降有關(guān)，還與腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解及間質(zhì)重構(gòu)等密切相關(guān)[8]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖對(duì)其治療有重要意義。miRNAs是一類(lèi)高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，越來(lái)越多的證據(jù)顯示其參與了對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞表型的調(diào)控[9]。Yuan等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-451可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移；Tian等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-15a是通過(guò)抑制TNFAIP1的表達(dá)而發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移的作用；最近Sun等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-646可以通過(guò)下調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)的表達(dá)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲。miR-133b已被證實(shí)是一種抑癌miRNAs，可調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲有關(guān)的抑癌基因或蛋白，從而發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用[10,11]。Duan等[12]檢測(cè)了31例份結(jié)腸癌組織和癌旁正常結(jié)腸組織中幾種miRNAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-133b在結(jié)腸癌組織中表達(dá)降低。最近研究證實(shí)，miR-133b可以調(diào)控卵巢癌細(xì)胞、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并與患者預(yù)后密切相關(guān)[13]。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b可以通過(guò)下調(diào)FSCN1而抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。p21和p27是與細(xì)胞周期有關(guān)的抑癌基因，p21、p27表達(dá)減少可以導(dǎo)致細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)；PCNA、Ki67是與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白，其表達(dá)升高可導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織miR-133b表達(dá)明顯低于正常骨組織，其p21、p27表達(dá)均降低，PCNA、Ki67表達(dá)均升高；說(shuō)明miR-133b表達(dá)異常與骨肉瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)。

KLF-4是真核鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖分化、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展等多種生理、病理過(guò)程中具有重要作用[15]。研究顯示，在肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等上皮源性腫瘤中KLF-4表達(dá)升高，表明KLF-4表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)；且KLF-4表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤靶向治療的一個(gè)靶位點(diǎn)[16]。Chang等[17]研究顯示，miR-7是通過(guò)抑制KLF-4/PI3K/AKT/P21信號(hào)通路而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織KLF-4蛋白表達(dá)升高,與miR-133b的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，推測(cè)miR-133b可能通過(guò)抑制KLF-4的表達(dá)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，骨肉瘤組織miR-133b表達(dá)降低；miR-133b可能通過(guò)下調(diào)KLF-4表達(dá)而參與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。KLF-4是否是miR-133b的靶基因及其具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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魏傳銀(E-mail： weichuanyin1967@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.021

R738.3

B

1002-266X(2016)48-0063-03