陽離子化牛血清白蛋白膜性腎病大鼠模型的建立與鑒定

彭素英，王玉潔，何宇，陶友麗,2，劉文佳,3，李婷，曹靈

(1 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2 重慶市第七人民醫(yī)院；3 自貢市第一人民醫(yī)院)

陽離子化牛血清白蛋白膜性腎病大鼠模型的建立與鑒定

彭素英1，王玉潔1，何宇1，陶友麗1,2，劉文佳1,3，李婷1，曹靈1

(1 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000；2 重慶市第七人民醫(yī)院；3 自貢市第一人民醫(yī)院)

目的 建立陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)膜性腎病(MN)大鼠模型。方法選取雄性SD大鼠33只，分為對照組5只，尾靜脈低、中、高劑量組各7只，腹腔組7只。尾靜脈低、中、高劑量組及腹腔組均皮下注射0.5 mg C-BSA和等體積不完全弗氏佐劑(ICFA)預(yù)先免疫1周，對照組皮下注射等體積生理鹽水和ICFA；1周后正式免疫：尾靜脈低、中、高劑量組分別隔日尾靜脈注射20、40、60 mg/kg C-BSA，腹腔組隔日腹腔注射60 mg/kg C-BSA，對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水。正式免疫4周，采用生化指標(TC、TG、血清白蛋白)、24 h尿蛋白定量(24 h UTP)、PASM染色、Masson染色、免疫熒光及電鏡觀察鑒定模型。結(jié)果與對照組比較，尾靜脈低、中、高劑量組TC、TG及24 h UTP均升高，血清白蛋白均降低，腹腔組24 h UTP升高(P均<0.05)。尾靜脈低、中、高劑量組PASM染色示腎小球基底膜(GBM)彌漫性增厚、釘突改變；Masson染色示腎小球上皮下嗜復(fù)紅復(fù)合物沉積；免疫熒光顯示IgG沿GBM呈細小顆粒狀沉積；電鏡下見GBM彌漫性增厚；病理改變呈劑量依賴性加重。腹腔組光鏡及電鏡未見明顯病理變化。結(jié)論成功采用尾靜脈注射C-BSA建立大鼠MN模型，臨床及病理鑒定符合MN的特征。

膜性腎病；陽離子化牛血清白蛋白；尾靜脈注射；腹腔注射；大鼠

膜性腎病(MN)是引起中老年人原發(fā)性腎病綜合征的常見原因，主要病理特點為腎小球基底膜(GBM)上皮側(cè)免疫復(fù)合物的沉積，GBM彌漫性增厚[1～3]。建立良好有效的動物模型對于MN的深入研究具有重要意義[4]。目前，MN常用的動物模型有被動型海曼性腎炎(PHN)模型和陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)模型。相對于PHN模型，C-BSA模型的造模成本低、成模率高、模型穩(wěn)定，但目前國內(nèi)外建立C-BSA模型所用的C-BSA劑量不統(tǒng)一，且均采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方式，方法相對復(fù)雜。2014年4～12月，本研究通過腹腔注射和尾靜脈注射不同劑量凍存多年的C-BSA制備大鼠MN模型，并進行鑒定，力求尋找一種建立簡單、方便、典型的MN大鼠模型的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性大鼠33只，體質(zhì)量150～160 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(川)2013-17。隨機分為對照組5只，尾靜脈注射低、中、高劑量組各7只，腹腔組7只。清潔環(huán)境飼養(yǎng)，室溫18～22 ℃，普通飼料飼養(yǎng)，瓶裝水自由飲水。C-BSA為9年前本課題組參照改良Border法[5]制備的等電點為8.4以上的粉劑，使用無菌玻璃瓶于-20 ℃密封存放。

1.2 動物分組及模型建立 大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，檢測24 h尿蛋白定量(24 h UTP)，24 h UTP<0.05 mg/d的大鼠進入實驗。尾靜脈低、中、高劑量組及腹腔組均皮下注射0.5 mg C-BSA和等體積不完全弗氏佐劑(ICFA)預(yù)免疫；對照組皮下注射等體積生理鹽水和ICFA。1周后進行正式免疫：尾靜脈低、中、高劑量組分別隔日尾靜脈注射20、40、60 mg/kg C-BSA，腹腔組隔日腹腔注射 60 mg/kg C-BSA，對照組尾靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3 模型鑒定 臨床鑒定： 正式免疫4周收集血液、尿液和腎臟標本做進一步檢查。血、尿標本均在瀘州醫(yī)學(xué)院檢驗科檢測，檢測指標包括TG、TC、血清白蛋白(ALB)、24 h UTP。病理鑒定：將腎臟組織分為三部分，分別進行PASM染色、Masson染色、免疫熒光和電鏡觀查：取1/2腎臟經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，進行PASM、Masson染色(送瀘州醫(yī)學(xué)院病理科)；取3 cm×3 cm的腎皮質(zhì)行IgG直接免疫熒光染色；取左腎上極2 mm×2 mm的腎皮質(zhì)，用戊二醛電鏡固定液固定后送四川大學(xué)華西醫(yī)院電鏡中心制備電鏡樣品，并進行拍照。

2 結(jié)果

對照組、尾靜脈低劑量組及腹腔組均無大鼠死亡，尾靜脈中劑量組分別于正式免疫2、3周末死亡1只；尾靜脈注射高劑量組在正式免疫2周末死亡2只，3周末死亡1只。

2.1 臨床特征鑒定結(jié)果 正式免疫4周，各組TC、TG、ALB及24 h UTP比較見表1。

表1 各組TC、TG、ALB及24 h UTP比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與腹腔組比較，△P<0.05。

2.2 病理學(xué)特征鑒定結(jié)果 正式免疫4周，PASM染色示尾靜脈低、中、高劑量組部分GBM空泡變性、綢緞樣變，部分增厚，偶有釘突形成、雙軌樣改變，隨劑量增加，病理改變加重；腹腔注射組見GBM綢緞樣變，無GBM增厚、釘突等病變。Masson染色示尾靜脈注射低、中、高劑量組少量上皮下嗜復(fù)紅復(fù)合物沉積，隨劑量增加，沉積物逐漸增多；對照組及腹腔組無免疫復(fù)合物沉積。免疫熒光示尾靜脈低、中、高劑量組IgG沿GBM呈細顆粒狀沉積，各組間無明顯差異；腹腔組少許IgG沿GBM沉積；對照組無沉積。電鏡下可見尾靜脈低、中、高劑量組GBM上皮側(cè)有電子致密物沉積，基底膜增厚，足突廣泛融合，隨劑量增加，電子致密物逐漸增多。

3 討論

MN發(fā)病機制復(fù)雜，近年來大量研究提示血清抗M型磷酯酶A2受體抗體(PLA2R)是MN的敏感性和特異性標記物，70%的活動性MN患者PLA2R呈中高表達[6～11]，但其機制尚未完全闡明，治療上仍存在很大爭議[12]。相對于PHN模型，C-BSA模型不僅臨床癥狀類似人類MN，基因改變與人類MN也高度相似[13]，即更具有人類MN的特征。目前制備C-BSA模型尚無統(tǒng)一的C-BSA用量，多是現(xiàn)配現(xiàn)用，程序復(fù)雜。

既往造模多采用16、50 mg/kg等劑量[5,13,14]，本實驗考慮C-BSA密封存放時間長，為尋求合適劑量及簡單方式，預(yù)實驗采用20、40、60、80 mg/kg尾靜脈注射及80 mg/kg腹腔注射，均為1周3次；預(yù)實驗結(jié)束時，80 mg/kg組大鼠全部死亡，可能為藥物劑量過大所致，故本實驗采用了20、40、60 mg/kg三種劑量尾靜脈注射，并首次探索腹腔注射的方式(60 mg/kg)。本實驗發(fā)現(xiàn)尾靜脈低、中、高劑量組呈腎病綜合征表現(xiàn)，且腎臟病理檢查示上皮下免疫復(fù)合物沉積，GBM彌漫性增厚，部分有釘突形成，IgG沿腎小球毛細血管壁細顆粒狀沉積，電鏡下見上皮下電子致密物沉積，與既往采用新鮮C-BSA制備MN大鼠模型效果相當[14]，均具有MN臨床及病理改變特點。病理改變呈C-BSA劑量依賴性加重，可能是C-BSA作為異種抗原或抗體進入體內(nèi)后易于與富含負電荷的GBM結(jié)合，從而形成免疫復(fù)合物，通過激活補體形成膜攻擊復(fù)合物C5b-9，進而損傷足細胞，導(dǎo)致GBM通透性改變、增厚等[1,15]，從而出現(xiàn)一系列臨床癥狀。本研究腹腔組有蛋白尿，但無明顯血液生化指標變化，有輕度的非特征性病理改變，可能因為造模時間不夠長或C-BSA腹腔注射吸收較少，導(dǎo)致實際吸收的C-BSA不足，甚或是本身腹腔注射不能制備MN大鼠模型，有待進一步研究。本實驗首次采用配制多年的C-BSA，通過尾靜脈注射成功建立MN大鼠模型，提示C-BSA配置后嚴格密封，-20 ℃保存9年仍有效，便于今后MN的科研工作，可節(jié)省C-BSA的制備時間及費用。

綜上所述，本實驗中采用存放多年的C-BSA分為三種不同劑量經(jīng)尾靜脈注射制備大鼠MN模型，經(jīng)過電鏡鑒定造模成功，且符合MN的臨床表現(xiàn)及病理特點。三個劑量比較，20 mg/kg C-BSA尾靜脈注射即可成功制備MN模型。

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四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(120342)；瀘州市科技局重點項目(2012-S-37)。

曹靈(E-mail: LZcaoling@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.011

R692.3

A

1002-266X(2016)48-0036-03

2015-10-29)