Eag1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響及其機(jī)制

袁忠，胡俊，雷家維，付璐珩，俞曾強(qiáng)，汪海燕

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院，南昌330006)

Eag1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響及其機(jī)制

袁忠，胡俊，雷家維，付璐珩，俞曾強(qiáng)，汪海燕

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院，南昌330006)

目的 探討Eag1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響及其機(jī)制。方法將骨肉瘤Saos-2細(xì)胞隨機(jī)分為Eag1沉默組和對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染Eag1 siRNA及scramble。分別采用熒光定量PCR法和Western blotting法檢測(cè)兩組Eag1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量；MTT法檢測(cè)兩組培養(yǎng)24、48、72、96及120 h的細(xì)胞增殖能力(以O(shè)D值表示)，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞遷移能力(以劃痕愈合率表示)，Transwell侵襲試驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞侵襲能力(以進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)量表示)；采用Western blotting法檢測(cè)兩組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果Eag1沉默組與對(duì)照組Eag1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.50±0.04、1.00±0.12，Eag1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.30±0.06、1.00±0.10，兩組比較P均<0.05。Eag1沉默組接種24、48、72、96及120 h的OD值均低于對(duì)照組(P<0.05或<0.01)。Eag1沉默組和對(duì)照組劃痕愈合率分別為42.34%±4.22%、95.12%±2.32%，進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)量分別為(352±32)、(642±34)個(gè)，STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.79±0.15、1.64±0.23，兩組比較P<0.05或<0.01。結(jié)論Eag1沉默可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲；下調(diào)STAT3蛋白表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

骨肉瘤；Eag1；STAT3；鉀離子通道蛋白；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

骨肉瘤細(xì)胞起源于成骨細(xì)胞[1，2]，具有腫瘤細(xì)胞特征，可形成不成熟的骨或骨組織。骨肉瘤惡性程度較高，外科手術(shù)結(jié)合新輔助化療的治療效果較好，患者5年生存率可達(dá)75%，但40%～50%的患者會(huì)發(fā)展為難治性轉(zhuǎn)移癌，預(yù)后較差[2]。近期研究表明，電壓門控鉀離子通道蛋白與骨肉瘤的發(fā)生密切相關(guān)，并有望成為骨肉瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)[3]。2015年1月～2016年1月，我們觀察了一種新的電壓門控鉀離子通道蛋白Eag1對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：骨肉瘤Saos-2細(xì)胞購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。試劑：實(shí)驗(yàn)所需的一抗購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的二抗購自英國Abcam公司，轉(zhuǎn)染試劑Liposome 2000、TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司。Eag1 siRNA以及scrambles均由上海吉瑪公司定制合成。

1.2 細(xì)胞分組處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Saos-2細(xì)胞隨機(jī)分為Eag1沉默組和對(duì)照組，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后利用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染Eag1 siRNA及scramble，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作。加入DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用于以下試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞Eag1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后加入TRIzol試劑，提取總RNA。按照TaqMan RNA reverse transcription kit說明書，將5 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。引物序列：Eag1上游引物：5′-GCTTTTGAGAACGTGGATGAG-3′，下游引物：5′-CGAAGATGGTGGCATAGAGAA-3′；以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：3′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-5′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 °C變性5 s，60 °C退火34 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算Eag1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞Eag1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后加入裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，濃縮膠80 V電泳40 min，分離膠100 V電泳2 h。常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；分別加入Eag1和GAPDH一抗(1∶200)孵育過夜，加入二抗(1∶1 000)孵育2 h，ECL法化學(xué)發(fā)光。采用Quantity One 1-D軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量分析，以Eag1與GAPDH灰度值的比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Eag1對(duì)Saos-2細(xì)胞增殖、遷移與侵襲影響的觀察

1.5.1 細(xì)胞增殖能力 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板。分別于接種24、48、72、96及120 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液40 μL。孵育4 h后每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上充分震蕩。采用酶標(biāo)儀測(cè)定兩組各時(shí)間點(diǎn)570 nm處的光密度值(OD值)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.5.2 細(xì)胞遷移能力 采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組細(xì)胞，以2×104個(gè)/孔接種于6孔板。細(xì)胞融合后，采用滅菌槍頭沿直線用力劃。分別于劃痕后即刻、48 h在顯微鏡下觀察劃痕修復(fù)情況，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻面積-劃痕后48 h面積)/劃痕后即刻面積×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。劃痕愈合率越高，表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.5.3 細(xì)胞侵襲能力 采用Transwell侵襲試驗(yàn)。將兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取2×104個(gè)接種于Transwell小室的碳酸磷脂表面，上室 BioCoatTM包被Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出上層小室，將膜下面的侵襲細(xì)胞與1%多聚甲醛混合，0.2%結(jié)晶紫溶液染色15 min。于200倍顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)量，取平均值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照1.4的方法，采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組Eag1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Eag1沉默組Eag1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.50±0.04，對(duì)照組為1.00±0.12，兩組比較P<0.05。Eag1沉默組Eag1蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.30±0.06，對(duì)照組為1.00±0.10，兩組比較P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 見表1。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力比較

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 兩組細(xì)胞遷移能力比較 Eag1沉默組劃痕愈合率為42.34%±4.22%，對(duì)照組為95.12%±2.32%，兩組比較P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 Eag1沉默組進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)量為(352±32)個(gè)，對(duì)照組為(642±34)個(gè)，兩組比較P<0.01。

2.5 兩組STAT3蛋白表達(dá)比較 Eag1沉默組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.79±0.15，對(duì)照組為1.64±0.23，兩組比較P<0.05。

3 討論

骨肉瘤好發(fā)于長(zhǎng)骨端，局部腫痛、跛行為其常見臨床表現(xiàn)，軟組織腫塊、骨皮質(zhì)增生及特征性的Codmans三角為其常見影像學(xué)特征[4]。骨肉瘤組織鏡下可見腫瘤細(xì)胞呈高度異型性，以梭形或多邊形為主，大小形態(tài)不一，可見病理性核分裂相。腫瘤分期、轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)、化療、解剖部位、腫瘤大小都可以影響骨肉瘤患者的預(yù)后[5]。研究報(bào)道，30歲以下的骨肉瘤患者5年生存率達(dá)60%，30～49歲患者為50%，而50歲以上者僅為30%[6]。現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為，腫瘤的發(fā)生是一系列基因(p53、p21等)表達(dá)發(fā)生異常改變的結(jié)果，而骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制目前仍不清楚。

近年來，鉀離子通道蛋白成為腫瘤生物學(xué)的研究熱點(diǎn)[7]。一些鉀離子通道蛋白，特別是Eag1與腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Eag基因于1969年克隆自黑腹果蠅[8]，由三個(gè)亞科形成：Eag、Erg (Eag相關(guān)基因)和Elk(Eag類似基因)，其中Eag的兩個(gè)成員分別是Eag1和Eag2[9]。正常生理狀況下，Eag1基因表達(dá)往往僅限于大腦組織；但部分腫瘤組織中Eag1卻出現(xiàn)異常高表達(dá)[10]。因此Eag1可能是一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物。Liu等[11]報(bào)道，Eag1表達(dá)與乳腺癌的腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特征相關(guān)。Eag1高表達(dá)與急性白血病、卵巢癌、結(jié)腸癌和食管癌預(yù)后差相關(guān)[12，13]，盡管已有研究證明Eag1在骨肉瘤組織中異常表達(dá)[14]，但其是否與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為有關(guān)卻依然未有定論。本研究結(jié)果顯示，Eag1沉默組Eag1 mRNA及其蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組，表明Eag1沉默組Eag1基因沉默成功。Eag1沉默組接種24、48、72、96及120 h的OD值均低于對(duì)照組，說明Eag1沉默可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖；Eag1沉默組劃痕愈合率和進(jìn)入膜下的細(xì)胞數(shù)量均低于對(duì)照組，說明Eag1沉默可抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。研究表明，Eag1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移[15]。本研究與上述報(bào)道結(jié)論一致。

STAT3蛋白與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，其中也包括骨肉瘤[16]。本研究結(jié)果顯示，Eag1沉默組STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說明Eag1基因沉默可下調(diào)STAT3蛋白表達(dá)。研究表明，沉默STAT3可調(diào)控血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而血管生長(zhǎng)因子與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)[17]。因此，我們推測(cè)沉默Eag1可能通過下調(diào)STAT3而調(diào)控血管生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而發(fā)揮抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的生物學(xué)效應(yīng)，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Eag1沉默可抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，下調(diào)STAT3蛋白表達(dá)可能是其作用機(jī)制。本研究為進(jìn)一步研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路，Eag1有望成為骨肉瘤診斷的一種潛在的生物標(biāo)記物，其是否可以成為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)仍需深入探討。

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