脂肪干細胞移植對兔前交叉韌帶損傷的修復作用及其機制

劉銘，王宇，劉欣偉，劉憲民，張玉彪，項良碧，劉松波

(沈陽軍區總醫院，沈陽110016)

·基礎研究·

脂肪干細胞移植對兔前交叉韌帶損傷的修復作用及其機制

劉銘，王宇，劉欣偉，劉憲民，張玉彪，項良碧，劉松波

(沈陽軍區總醫院，沈陽110016)

目的 觀察脂肪干細胞(ADSCs)移植對兔前交叉韌帶(ACL)損傷的修復作用，并探討其對韌帶組織轉化生長因子β(TGF-β)和Ⅰ型膠原表達的影響。方法無菌條件下切取1只新西蘭大白兔的腹股溝下脂肪組織，分離提取ADSCs(經CD43免疫熒光染色證實)。將45只新西蘭大耳白兔隨機分為假手術組、模型組和移植組，每組15只。模型組和移植組均切斷75%的ACL，移植組同時在韌帶損傷處注入10 μL第3代ADSCs懸液，假手術組只暴露韌帶、不切開。記錄術后各組動物飲食、飲水、運動等一般情況，術后第4周處死后采集ACL標本，分別采用實時熒光定量PCR法和Western blotting法檢測TGF-β、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量。結果假手術組麻醉恢復后即可正常飲水飲食，被毛有光澤，精神狀態良好，運動情況與術前比較無變化。模型組飲食飲水較少，被毛無光澤，精神狀態差，存在運動障礙。移植組飲食飲水情況與假手術組相近，被毛光澤度不佳，精神狀態較模型組好，存在輕微運動障礙，但運動能力恢復情況較模型組好。與假手術組比較，模型組和移植組TGF-β mRNA和蛋白相對表達量均升高，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β mRNA和蛋白相對表達量均降低，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白相對表達量均升高(P均<0.05)。結論ADSCs移植可以促進ACL損傷兔的韌帶修復；降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達可能是其作用機制。

前交叉韌帶損傷；脂肪干細胞；轉化生長因子β；Ⅰ型膠原；兔

隨著全民健身運動的開展，韌帶損傷在創傷骨科中的比例逐漸升高，其中以前交叉韌帶(ACL)損傷發病率最高[1～3]。研究表明，干細胞移植可以在移植區域產生新的血管，為創傷恢復和治療提供了條件[4]。脂肪干細胞(ADSCs)來源比較廣泛，容易獲取，是目前干細胞移植的研究熱點。2014年5月～2015年7月，本研究觀察了ADSCs移植修復兔ACL損傷的效果及其對韌帶組織轉化生長因子β(TGF-β)和Ⅰ型膠原表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康成年新西蘭大白兔46只，雌雄不限，體質量2.0～3.0 kg，由沈陽軍區總醫院動物實驗科提供。試劑：戊巴比妥鈉購于成都化學制劑廠，DMEM培養基、青鏈霉素、胎牛血清均購于美國Hyclone公司，Ⅰ型膠原酶購于美國Sigma公司，反轉錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，caspase-3和c-fos大鼠抗兔抗體、二抗山羊抗鼠均購于北京索來寶生物科技有限公司。

1.2 兔ADSCs分離、鑒定 ①兔ADSCs分離：隨機選取1只新西蘭大白兔，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉處死，將動物進行消毒，于無菌條件下切取腹股溝下脂肪組織。在體視顯微鏡下去除脂肪組織上可見的血管和筋膜，無菌預冷PBS緩沖液沖洗3遍，用手術眼科剪將其剪成泥狀。加入0.15% Ⅰ型膠原酶3 mL，置于CO2培養箱中消化60 min，消化后將懸液過100目細胞篩。將濾液放入離心機中，1 000 r/min離心10 min；棄上清，采用含10%胎牛血清的DMEM培養基進行重懸，接種于培養皿中，顯微鏡下觀察細胞形態。②兔ADSCs鑒定：待細胞生長融合至80%～90%時進行傳代，細胞傳代至第3代時采用載玻片制作細胞爬片，95%乙醇脫水固定。PBS沖洗后吸干水分，滴加一抗放入濕盒內4 ℃過夜，PBS沖洗，加入二抗37 ℃孵育，最后PBS洗凈封片，嚴格按照CD43免疫熒光試劑盒說明進行操作。熒光顯微鏡下進行觀察，以CD43免疫熒光染色呈綠色定義為陽性染色。鑒定結果顯示，分離出來的細胞中有較多的雜細胞；培養2天后培養皿中能夠見到三角形或小多角形的細胞，大小不一，細胞核較大，傳代后細胞分布均勻；ADSCs表面標志因子CD43染色結果呈現陽性。證實分離培養的細胞為ADSCs。

1.3 造模與分組處理 將剩余45只健康新西蘭大白兔隨機分為假手術組、模型組和移植組，每組15只。各組均采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg耳緣靜脈緩慢注射麻醉，將動物仰臥位固定于動物解剖臺上，剃毛，局部碘伏消毒，切開皮膚，暴露膝關節腔和ACL。模型組將ACL中部切斷75%，縫合修復韌帶后逐層縫合切口。移植組將ACL中部切斷75%，縫合腱膜組織，于韌帶損傷處注入10 μL第3代ADSCs懸液(細胞密度為1×106個/μL)，逐層縫合切口。假手術組僅暴露ACL，不切斷，然后逐層縫合切口。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 一般情況及ACL損傷修復情況 記錄各組術后飲水飲食、運動等一般情況。術后4周，各組均采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉處死，取出ACL組織，肉眼觀察損傷修復情況后置于-80 ℃保存。

1.4.2 ACL組織TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。取出ACL組織，于液氮中進行研磨，加入TRIzol試劑，提取總RNA。根據反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，反應體系為10 μL，反應條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s。TGF-β上游引物：5′-TGCTTCAGCTCCACAGAGAA-3′，下游引物：5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3′，片段長度125 bp；Ⅰ型膠原上游引物：5′-GCGGTGGTTACGAC-TTTGGTT-3′，下游引物：5′-AGTGAGGAGGGTCTCAATCTG-3′，片段長度144 bp。以β-actin為內參，上游引物：5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，片段長度141 bp。反應體系25 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，變性、退火和延伸共40個循環，72 ℃延伸5 min。以2-ΔΔCt法計算TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA相對表達量。

1.4.3 ACL組織TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白表達 采用Western blotting法。取各組ACL組織，于冰浴條件下采用勻漿機進行勻漿，提取總蛋白，對提取蛋白進行定量，然后進行蛋白變性、電泳轉膜、一抗和二抗孵育，嚴格按照試劑盒說明書操作。顯影定影，拍照后采用圖像分析軟件對電泳條帶灰度值進行分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值表示TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況及ACL損傷修復情況 假手術組麻醉恢復后即可正常飲食飲水，被毛有光澤，精神可，運動情況與術前比較無變化。模型組飲食飲水較少，被毛無光澤，精神狀態差，存在明顯運動障礙，自主運動能力較差。移植組飲食飲水情況與假手術組相近，被毛光澤度不佳，精神狀態較模型組好，存在輕微運動障礙，但運動能力恢復情況較模型組好。移植組肉眼觀察不到ACL損傷，與假手術組相近；模型組可見明顯的ACL損傷。

2.2 TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA表達 與假手術組比較，模型組和移植組TGF-β mRNA相對表達量均升高、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β mRNA相對表達量降低、Ⅰ型膠原mRNA相對表達量升高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組TGF-β和Ⅰ型膠原mRNA相對表達量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白表達 與假手術組比較，模型組和移植組TGF-β蛋白相對表達量均升高、Ⅰ型膠原蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。與模型組比較，移植組TGF-β蛋白相對表達量降低、Ⅰ型膠原蛋白相對表達量升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組TGF-β和Ⅰ型膠原蛋白相對表達量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

韌帶損傷是指由于各種原因造成韌帶撕裂或者斷裂，可導致運動功能受限。韌帶的主要成分是細胞外基質和基質中間的成纖維細胞，韌帶損傷后的愈合期主要是成纖維細胞發揮修復作用[3]。韌帶損傷后首先是局部發生出血、炎癥反應和細胞增殖，由于韌帶是結締組織，所以損傷時韌帶出血導致的血塊形成并不明顯[2]。在炎癥反應初期階段，損傷部位會出現大量巨噬細胞，其作用是調整促進韌帶愈合所必需的環境；炎癥反應的后期可出現細胞增殖和膠原產生。因此韌帶損傷的愈合是一個長期過程，一般會持續數月至數年[4～6]。

干細胞具有在一定條件下分化成其他細胞的能力，目前已經逐漸應用于臨床疾病的治療，例如造血干細胞移植治療白血病、脊髓損傷后利用神經干細胞移植促進脊髓神經元再生和功能恢復等。研究發現，間充質干細胞移植能夠促進大鼠韌帶損傷處干細胞向成纖維細胞分化，從而促進韌帶損傷處的愈合[7，8]。但是臨床上對于干細胞治療韌帶損傷的研究比較少，尤其是ADSCs移植[9，10]。本研究結果顯示，模型組出現明顯運動障礙，而移植組僅存在輕微運動障礙，且運動能力恢復情況較模型組好。說明ADSCs移植可促進ACL損傷的修復。

Ⅰ型膠原是韌帶的重要組成部分，在韌帶中的干重比可達80%，是提高組織伸拉強度的重要因素。在韌帶損傷的愈合過程中，Ⅰ型膠原表達可間接反映韌帶的愈合情況[11～13]。研究發現，韌帶損傷后會產生大量TGF-β，主要是由傷口處釋放，可促進瘢痕成熟和抑制韌帶愈合[14～16]。本研究結果顯示，假手術組、移植組、模型組TGF-β mRNA和蛋白表達依次升高，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達依次降低。證實ADSCs移植可降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達，可能是其促進損傷韌帶修復的機制之一。

綜上所述，ADSCs移植可促進ACL損傷兔的韌帶修復；降低TGF-β表達、升高Ⅰ型膠原表達可能是其作用機制。本研究為干細胞治療韌帶損傷提供了一定的理論基礎，但更多的作用機制還需要深入研究。

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遼寧省科技攻關計劃項目(2013020175)；遼寧省自然科學基金資助項目(2013225089)。

劉松波(E-mail： luzongguke@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.008

R686.5

A

1002-266X(2016)48-0028-03

2015-12-14)