鹽霉素對人鼻咽癌CNE2/DDP細胞順鉑耐藥的影響及其機制

陳冬杰，廖雪陽，陳可緒，李毅斌，汪森明

(南方醫科大學珠江醫院，廣州510282)

鹽霉素對人鼻咽癌CNE2/DDP細胞順鉑耐藥的影響及其機制

陳冬杰，廖雪陽，陳可緒，李毅斌，汪森明

(南方醫科大學珠江醫院，廣州510282)

目的 探討鹽霉素對人鼻咽癌CNE2/DDP細胞順鉑耐藥的影響及其可能的作用機制。方法將人鼻咽癌CNE2/DDP細胞隨機分為四組，分別加入2 μg/mL順鉑(順鉑組)、8 μmol/L鹽霉素(鹽霉素組)、2 μg/mL順鉑和8 μmol/L鹽霉素(聯合組)、0.1%二甲基亞砜(對照組)進行處理。采用CCK-8法檢測各組細胞增殖抑制率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blotting法檢測Wnt/β-catenin信號通路(β-catenin、p-LRP6)、mTORc1信號通路(P70S6K、p-P70S6K、S6、p-S6)相關蛋白相對表達量，熒光分光光度法檢測caspase3、caspase9活性。結果與對照組比較，順鉑組、鹽霉素組、聯合組細胞增殖抑制率、凋亡率和caspase3、caspase9活性均升高(P均<0.05)；順鉑組、鹽霉素組和聯合組上述指標均逐漸升高，兩兩比較P均<0.05。β-catenin、p-LRP6、p-P70S6K、p-S6蛋白相對表達量：順鉑組和對照組均高于鹽霉素組和聯合組(P均<0.05)，順鉑組與對照組、鹽霉素組與聯合組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。P70S6K、S6蛋白相對表達量：各組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論鹽霉素可以逆轉人鼻咽癌CNE2/DDP細胞的順鉑耐藥；激活caspase活性、抑制Wnt/β-catenin和mTORc1信號通路可能是其作用機制。

鼻咽癌；鹽霉素；順鉑；耐藥；細胞凋亡

鼻咽癌是致死率最高的頭頸部腫瘤[1,2]，放療是惟一可能治愈早期鼻咽癌的方法[3]，聯合放化療是局部晚期鼻咽癌的標準治療方法[4]。順鉑是中晚期鼻咽癌常用的化療藥物之一，但部分患者治療過程中會對順鉑產生耐藥性，大大降低了療效[5,6]。鹽霉素是一種選擇性乳腺癌干細胞抑制物，可抑制多種腫瘤細胞的增殖和分化[7]。2015年4月～2016年1月，我們觀察了鹽霉素對人鼻咽癌CNE2/DDP細胞順鉑耐藥的影響，現分析結果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌CNE2/DDP細胞由南方醫科大學腫瘤研究所饋贈，采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。藥物及試劑：順鉑由珠江醫院腫瘤中心提供，鹽霉素購于美國Sigma公司，均溶于二甲基亞砜(DMSO)中，于-20 ℃冰箱中避光保存。抗p-LRP6(Ser1490) 抗體購于英國Abcam公司，抗S6抗體、抗p-S6(Ser235/236)、抗P70S6K抗體、抗p-P70S6K(Thr389)抗體、抗β-catenin抗體、抗GADPH抗體均購于美國Affinity公司。

1.2 細胞增殖抑制率檢測 采用CCK-8法。取對數生長期的CNE2/DDP細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL，培養24 h，隨機分為順鉑組、鹽霉素組、聯合組和對照組。取出溶于DMSO的順鉑和鹽霉素，采用RMPI 1640培養基將其濃度調整為2 μg/mL和8 μmol/L。順鉑組加入含2 μg/mL順鉑的培養基100 μL，鹽霉素組加入含8 μmol/L鹽霉素的培養基100 μL，聯合組加入含2 μg/mL順鉑及8 μmol/L鹽霉素的培養基100 μL，對照組加入含0.1% DMSO的培養基100 μL，每組設置5個復孔。作用48 h后終止培養，每孔中加入預先配好的CCK-8試劑，繼續放入孵育箱中培養2 h。取出培養板，酶標儀450 nm波長下測定各孔光密度值(OD值)，實驗重復3次。細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。取對數生長期CNE2/DDP細胞，調整細胞密度為1.5×105個/mL，接種于6孔板中，每孔1 mL，培養24 h。順鉑組加入含2 μg/mL順鉑的培養基2 mL，鹽霉素組加入含8 μmol/L鹽霉素的培養基2 mL，聯合組加入含2 μg/mL順鉑及8 μmol/L鹽霉素的培養基2 mL，對照組加入含0.1% DMSO的培養基2 mL。作用48 h后終止培養，將舊培養液轉移至10 mL離心管內。收集各孔細胞并轉移至舊培養液所在離心管中，采用胰酶進行消化(已去除EDTA)，1 000 r/min離心5 min，去上清。收集細胞，采用4 ℃預冷的PBS洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，棄上清。400 μL Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，加入5 μL Propidium Iodide混勻。在室溫、避光條件下反應10 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，實驗重復3次。

1.4 Wnt/β-catenin、mTORc1信號通路相關蛋白表達檢測 參照1.3的方法進行接種及分組處理，作用48 h后采用4 ℃預冷的PBS進行洗滌，棄上清。每孔加入200 μL RIPA裂解液，冰上裂解20～30 min。將裂解的細胞收集至EP管中，于4 ℃條件下1 200 r/min離心20 min，將含蛋白的上清轉移到新的EP管中。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳濕轉至PVDF膜，轉移至4 ℃冰箱中，5% BSA封閉2 h，加入一抗孵育過夜。PBS洗滌PVDF膜3次，每次15 min；加入HRP標記的二抗，室溫下孵育1 h；PBS洗滌3次，每次15 min。進行ECL化學發光反應及曝光，以GADPH作為對照，實驗重復3次。Wnt/β-catenin信號通路(β-catenin、p-LRP6)、mTORc1信號通路(P70S6K、p-P70S6K、S6、p-S6)蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值與GADPH灰度值的比值表示。

1.5 caspase3、caspase9活性檢測 采用熒光分光光度法。參照1.3的方法進行接種及分組處理，作用48 h后，收集細胞。冰上裂解30 min，4 ℃條件下1 200 r/min離心1 min，取上清置于EP管。加入相應的caspase底物，充分混勻后，加入96孔板中，避光孵育4 h。每組設置3個復孔，以酶標儀405 nm波長下各孔OD值表示caspase3、caspase9活性。實驗重復3次。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率和凋亡率比較 與對照組比較，順鉑組、鹽霉素組、聯合組細胞增殖抑制率和凋亡率均升高(P均<0.05)。順鉑組、鹽霉素組和聯合組細胞增殖抑制率和凋亡率均逐漸升高，兩兩比較P均<0.05。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率和凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05；與鹽霉素組比較，△P<0.05。

2.2 各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達比較 順鉑組和對照組 β-catenin、p-LRP6蛋白相對表達量均高于鹽霉素組和聯合組(P均<0.05)；順鉑組和對照組比較、鹽霉素組和聯合組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

2.3 各組mTORc1信號通路相關蛋白表達比較 各組P70S6K、S6蛋白相對表達量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。順鉑組和對照組p-P70S6K、p-S6蛋白相對表達量均高于鹽霉素組和聯合組(P均<0.05)；順鉑組和對照組比較、鹽霉素組和聯合組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組mTORc1信號通路相關蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05。

2.4 各組caspase3、caspase9活性比較 與對照組比較，順鉑組、鹽霉素組和聯合組caspase3、caspase9活性均升高(P均<0.05)。鹽霉素組、順鉑組和聯合組caspase3、caspase9活性均逐漸升高，兩兩比較P均<0.05。見表4。

3 討論

在鼻咽癌的治療中，逆轉順鉑耐藥性藥物的研究為當前熱點。鹽霉素可抑制多種腫瘤細胞，包括肝癌[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]、前列腺癌[11]、腸癌[12]、鼻咽癌[13]等，但其對鼻咽癌細胞的作用及其對順鉑耐藥性影響的報道較少。前期研究顯示，順鉑作用于CNE2/DDP細胞的IC50為5.93 μg/mL，鹽霉素為10 μmol/L，結合相關參考文獻，本研究分別選取低于兩種藥物IC50的濃度為工作濃度，分別為2 μg/mL、8 μmol/L[13,14]。本研究結果顯示，聯合組細胞增殖抑制率和凋亡率均明顯高于順鉑組、鹽霉素組。提示鹽霉素能提高CNE2/DDP細胞對順鉑的敏感性，并逆轉其對順鉑的耐藥性；鹽霉素聯合順鉑可能成為鼻咽癌順鉑耐藥患者的一種新的治療方案。

表4 各組caspase3、caspase9活性比較(OD值

注：與對照組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，#P<0.05；與鹽霉素組比較，△P<0.05。

研究表明，鹽霉素對鼻咽癌細胞的抑制作用可能與其抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，但具體的機制并未完全清楚[14]。Wnt/β-catenin、mTORc1信號通路均與腫瘤的增殖和侵襲密切相關，且兩條通路之間可能存在交叉[15～19]。因此能夠同時抑制Wnt/β-catenin信號通路及mTORc1信號通路的物質有可能成為新型的抗腫瘤藥物。LRP6是Wnt/β-catenin信號通路中的關鍵Wnt協同受體，LRP6的磷酸化在Wnt/β-catenin信號通路的激活過程中起關鍵作用[20,21]。本研究發現，順鉑組和對照組 β-catenin、p-LRP6、p-P70S6K、p-S6蛋白相對表達量均高于鹽霉素組和聯合組，而順鉑組和對照組比較、鹽霉素組和聯合組比較差異均無統計學意義。提示鹽霉素可同時抑制Wnt/β-catenin與mTORc1信號通路，而順鉑無此作用；鹽霉素提高CNE2/DDP細胞的順鉑敏感性、逆轉其耐藥性的作用機制可能與其抑制Wnt/β-catenin與mTORc1信號通路有關。本研究鹽霉素組、順鉑組和聯合組caspase3、caspase9活性逐漸升高，說明caspase的激活可能是鹽霉素作用的另一種相關機制。

綜上所述，鹽霉素可以逆轉人鼻咽癌CNE2/DDP細胞的順鉑耐藥性；激活caspase活性、抑制Wnt/β-catenin和mTORc1信號通路可能是其作用機制。

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一些常用詞匯可直接用縮寫

胎牛血清(FBS) 體質量指數(BMI) 天冬氨酸轉氨酶(AST)

磷酸鹽緩沖液(PBS) 總膽固醇(TC) 人類免疫缺陷病毒(HIV)

變異系數(CV) 甘油三酯(TG) 甲型肝炎病毒(HAV)

磁共振成像(MRI) 低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 乙型肝炎病毒(HBV)

血紅蛋白(Hb) 高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 丙型肝炎病毒(HCV)

核因子-κB(NF-κB) 重癥監護病房(ICU) 酶聯免疫吸附測定(ELISA)

逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR) 嚴重急性呼吸綜合征(SARS) 動脈血氧分壓(PaO2)

腫瘤壞死因子(TNF) 動脈血二氧化碳分壓(PaCO2) 干擾素(IFN)

凝血酶時間(TT) 一氧化氮(NO) 白細胞介素(IL)

Effect of salinomycin on cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma cells CNE2/DDP and its mechanisms

CHENDongjie,LIAOXueyang,CHENKexu,LIYibin,WANGSenming

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China)

Objective To investigate the effect of salinomycin on the cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma CNE2/DDP cells and its possible mechanisms. Methods CNE2/DDP cells were randomly divided into four groups, which were separately treated with 2 μg/mL cisplatin (cisplatin group), 8 μmmol/L salinomycin (salinomycin group), 8 μmmol/L salinomycin + 2 μg/mL cisplatin (combination group) and 0.1%DMSO (control group). Inhibitory rate of proliferation was assessed by the Cell Counting Kit 8. Apoptosis rate was measured by flow cytometry. Caspases3 and caspase9 activity was assessed by a colorimetric assay utilizing specific substrates. The protein expression of Wnt/β-catenin signaling pathway (β-catenin and p-LRP6) as well as mTORc1 signaling pathway (P70S6K, p-P70S6K, S6, and p-S6) was evaluated by Western blotting. Results Compared with the control group, the inhibitory rate, apoptosis rate, Caspase-3/9 activity were increased in the cisplatin group, salinomycin group, and combination group (allP<0.05). Indexes mentioned above were increased the most in the combination group while salinomycin group ranked the second and cisplatin group ranked the third (allP<0.05). The expression of β-catenin, p-LRP6, p-P70S6K, and p-S6: the salinomycin group and combination group was decreased as compared with the cisplatin group and control group (allP<0.05). Meanwhile, no significant differences were found between salinomycin group and combination group as well as between the cisplatin group and control group (allP>0.05). No significant difference was found in the expression of P70S6K and S6 between these four groups (allP>0.05). Conclusion Salinomycin can reverse the cisplatin resistance of human nasopharyngeal carcinoma cells CNE2/DDP which is possibly mediated by improving caspases activity and inhibiting both Wnt/β-catenin signaling pathway and mTORC1 signaling pathway.

nasopharyngeal carcinoma; salinomycin; cisplatin; drug resistance; apoptosis

廣州市科技計劃項目(2011Y2-00019-3)。

陳冬杰(1988-)，男，碩士在讀，研究方向為鹽霉素的抗腫瘤作用。E-mail： 15913106573@163.com

汪森明(1955-)，男，主任醫師，博士生導師，研究方向為腫瘤內科治療、惡性腫瘤介入治療、射頻消融治療。E-mail： wsenming@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.006

R739.6

A

1002-266X(2016)48-0020-04

2016-03-29)