miR-214在狼瘡性腎炎小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制

姚菲菲，孫立秋，方偉，王化民，姚東升，崔蕊，徐佳，王莉，王秀梅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，哈爾濱150001)

miR-214在狼瘡性腎炎小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制

姚菲菲，孫立秋，方偉，王化民，姚東升，崔蕊，徐佳，王莉，王秀梅

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，哈爾濱150001)

目的 探討微小RNA-214(miR-214)在狼瘡性腎炎(LN)小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖中的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法將MRL-Faslpr/JNju小鼠(簡稱LN小鼠，20只)和野生型小鼠(20只)處死，分離、培養(yǎng)其腎小球系膜細(xì)胞；將LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics(觀察組)和NC mimics control(對照組)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測兩種小鼠及兩組腎小球系膜細(xì)胞miR-214相對表達(dá)量，采用MTT法檢測兩組轉(zhuǎn)染1、2、3天的細(xì)胞增殖抑制率。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測細(xì)胞中miR-214的靶基因，并經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證，YKL-40是miR-214的靶基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blotting法檢測兩組YKL-40 mRNA及蛋白相對表達(dá)量。取對數(shù)生長期的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染siYKL-40和negative control，采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染1、2、3天的細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果LN小鼠和野生型小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-214相對表達(dá)量分別為0.35±0.09、1，兩者比較P<0.01。觀察組和對照組miR-214相對表達(dá)量分別為85.54±12.07、1，兩組比較P<0.01。觀察組轉(zhuǎn)染1、2、3天的細(xì)胞增殖抑制率均高于對照組(P<0.05或<0.01)。與對照組比較，觀察組YKL-40 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均降低(P均<0.05)。與轉(zhuǎn)染negative control比較，轉(zhuǎn)染siYKL-40的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染1、2、3天的細(xì)胞增殖抑制率均升高(P<0.05或<0.01)。結(jié)論LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞中miR-214表達(dá)降低，上調(diào)miR-214表達(dá)可抑制其增殖；下調(diào)YKL-40表達(dá)可能是miR-214的作用機(jī)制。

狼瘡性腎炎；微小RNA-214；腎小球系膜細(xì)胞；細(xì)胞增殖；YKL-40；小鼠

腎小球系膜細(xì)胞過度增殖是狼瘡性腎炎(LN)的主要病變特點(diǎn)，過度增殖的系膜細(xì)胞可以釋放更多的炎癥因子，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，加劇炎癥和引起腎小球硬化。微小RNA分子(microRNAs)簡稱miRNAs，廣泛參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、腫瘤形成及損傷修復(fù)等生理病理過程[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)，LN組織中有36個miRNAs 表達(dá)上調(diào)、30個 miRNAs表達(dá)下調(diào)，關(guān)于miR-214 在LN發(fā)生、發(fā)展中的作用報(bào)道較少[3]。2014年1月，我們觀察了miR-214對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖能力的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物：10周齡MRL-Faslpr/JNju小鼠(簡稱LN小鼠)20只，體質(zhì)量(24.5±2.6)g；10周齡野生型小鼠20只，體質(zhì)量(22.3±1.8)g；均為SPF級，由南京大學(xué)動物模式研究所提供。②試劑：總RNA提取試劑(TRIzol試劑)、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均購于美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit)、SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit均購于日本TaKaRa公司，miR-214 mimics(5′-UCAUGUGUCUGCCUGUCUACACUU-3′)及YKL-40 siRNA(5′-CCAGAUGCCCUUGACCGCUUCCUCU-3′)均購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，鼠YKL-40(ab86428)單克隆抗體購于英國Abcam公司，雙熒光素酶檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2 腎小球系膜細(xì)胞miR-214表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將LN小鼠和野生型小鼠處死，參照Costa-Reis等[4]的方法分離、培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞，并予以鑒定。取培養(yǎng)3～6代對數(shù)期生長的腎小球系膜細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit試劑盒說明書操作。miR-214上游引物 5′-TGGCTGGACAGAGTTGTCATGTGT -3′，下游引物為日本TaKaRa公司試劑盒提供的通用引物；以U6作為內(nèi)參，上游引物5′-GCACCATGCTCTTCTACTCCTTT-3′，下游引物5′-TGACACTGATGTCGGTTAGTTTGATA-3′。反應(yīng)體系：模版cDNA 1 μL，miR-214特異性引物 0.4 μL，10×miScript Universal Primer 2 μL，2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR 10 μL，加RNase-free water至反應(yīng)總體積為20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共45個循環(huán)。以2-ΔΔCT法[5]計(jì)算miR-214相對表達(dá)量。

1.3 miR-214對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響

1.3.1 miR-214 mimics轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)3～6代對數(shù)期生長的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞，按2×105個/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞融合至50%～70%時(shí)換為無血清無雙抗培養(yǎng)基。將LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics(觀察組)和NC mimics control(對照組)，嚴(yán)格按照 lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。培養(yǎng)6 h后，換為有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，參照1.2的方法檢測miR-214相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 采用MTT法。將1.3.1中分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和NC mimics control的兩組細(xì)胞接種于96 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為8 000～9 000個，每孔設(shè)置3個復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞融合至75%左右時(shí)，每孔加入 16 μL MTT(5 g/L)作用4 h，棄去上清，加入130 μL二甲亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，以450 nm波長時(shí)的光密度值(OD值)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，取平均值。連續(xù)檢測3天。

1.4 miR-214的靶基因預(yù)測及驗(yàn)證

1.4.1 靶基因生物信息學(xué)預(yù)測 采用TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRanda(http://www. targetscan.org/)和PicTar(http://pictar.mdc-berlin. de/)等生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-214的靶基因，結(jié)果提示YKL-40是其靶基因。

1.4.2 靶基因驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)。方法如下：①構(gòu)建靶基因熒光素酶報(bào)告基因：參照1.2的方法，分離、培養(yǎng)LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞，提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，按以下引物擴(kuò)增靶基因YKL-40的3′-UTR區(qū)域。上游引物：5′-CCGCTCGAGCCCTCTGTTCTGCACACAGCACGGG-3′(XhoⅠ)，下游引物： 5′-AAGGAAA-AAAGCGGCCGCAATAAAGTACAAGAGCTTAACAG-TG-3′(NotⅠ)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用XhoⅠ+NotⅠ雙酶切后，接入同樣經(jīng)過XhoⅠ+NotⅠ雙酶切的雙熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK2中，將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，采用PCR法鑒定菌落。將含有目的片段的菌落進(jìn)行搖菌，按照質(zhì)粒提取試劑盒方法提取質(zhì)粒，將提取好的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列驗(yàn)證。YKL-40 mRNA 3′-UTR結(jié)合miR-214的互補(bǔ)序列進(jìn)行GGACGAC到UUGAUGA點(diǎn)突變，此序列由上海生工生物工程有限公司制備，并經(jīng)測序驗(yàn)證。②雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證：將1.3.1中分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和NC mimics control的兩組細(xì)胞接種于24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為4×104個。當(dāng)細(xì)胞融合至75%左右時(shí)，分別轉(zhuǎn)染psiCHECK2-YKL-40-3′-UTR-WT(野生型)、psiCHECK2-YKL-40-3′-UTR-MUT(突變型)，嚴(yán)格按照lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后裂解細(xì)胞，分別檢測螢火蟲及海腎熒光素酶的熒光強(qiáng)度，計(jì)算相對熒光素酶活性。結(jié)果證實(shí)YKL-40為miR-214的靶基因，miR-214與YKL-40 mRNA 3′-UTR結(jié)合區(qū)域預(yù)測為GGACGAC。觀察組野生型和突變型相對熒光素酶活性分別為40.21%±3.37%、1，對照組分別為98.72%±5.64%、1；觀察組野生型和突變型比較P<0.05。

1.5 miR-214對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞YKL-40表達(dá)的影響

1.5.1 miR-214對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞YKL-40 mRNA表達(dá)的影響 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取1.3.1中分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和NC mimics control的兩組細(xì)胞，以GAPDH為內(nèi)參，參照1.2的方法檢測YKL-40 mRNA相對表達(dá)量。

1.5.2 miR-214對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞YKL-40蛋白表達(dá)的影響 采用Western blotting法。取1.3.1中分別轉(zhuǎn)染miR-214 mimics和NC mimics control的兩組細(xì)胞，加入10 μL RIPA裂解液，10 min后提取總蛋白，并測定蛋白濃度。將提取好的蛋白采用BCA定量試劑盒定量到5 μg/μL，按比例加入5×SDS上樣緩沖液，105 ℃加熱15 min。制備SDS聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量為20 μL，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。加入抗YKL-40抗體(ab86428，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入相應(yīng)的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST洗滌3次，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片，于室溫下自然風(fēng)干，掃描儀掃描結(jié)果。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為YKL-40蛋白相對表達(dá)量。

1.6 YKL-40對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 取培養(yǎng)3～6代對數(shù)生長期的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞，按2×105個/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁且細(xì)胞融合為50%～70%時(shí)換為無血清無雙抗培養(yǎng)基。參照1.3.1的方法分別轉(zhuǎn)染siYKL-40和negative control，采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染1、2、3天的細(xì)胞增殖抑制率。

2 結(jié)果

2.1 腎小球系膜細(xì)胞miR-214表達(dá) LN小鼠和野生型小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-214相對表達(dá)量分別為0.35±0.09、1，兩者比較P<0.01。觀察組和對照組miR-214相對表達(dá)量分別為85.54±12.07、1，兩組比較P<0.01。

2.2 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.3 兩組YKL-40 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較 觀察組和對照組YKL-40 mRNA相對表達(dá)量分別為0.37±0.09、1，YKL-40蛋白相對表達(dá)量分別為0.21±0.07、1，兩組比較P均<0.05。

2.4 YKL-40對LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響 見表2。

表2 轉(zhuǎn)染siYKL-40和negative control的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與轉(zhuǎn)染negative control的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

miRNAs主要與靶基因mRNA的3′-UTR 區(qū)域結(jié)合，通過降解或轉(zhuǎn)錄后抑制或減少靶基因蛋白的形成。自1993年miRNAs家族成員lin-4和let-7被發(fā)現(xiàn)以來，臨床上通過分子克隆及生物信息學(xué)方法至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9 000多種miRNAs，人類基因組編碼了超過1 000個miRNAs[6]。miR-214屬于miRNAs家屬成員之一，關(guān)于miR-214的研究主要集中在腫瘤診斷與治療方面。如miR-214在結(jié)腸癌和膀胱癌中表達(dá)明顯降低，并可作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物[7,8]。miR-214可以通過下調(diào)p53基因表達(dá)而顯著抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[9]，還可作為抑癌基因調(diào)控食管癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。本研究結(jié)果顯示，LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-214相對表達(dá)量明顯低于野生型小鼠，表明miR-214表達(dá)降低與LN的發(fā)生有關(guān)；而轉(zhuǎn)染miR-214 mimics的觀察組miR-214表達(dá)明顯升高，且可以明顯抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間依賴性，表明過表達(dá)miR-214可顯著抑制LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)YKL-40為miR-214的靶基因，獲取了YKL-40 mRNA 的3′-UTR序列，通過生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)YKL-40 3′-UTR存在miR-214的保守結(jié)合位點(diǎn)；雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示，miR-214可降低野生型報(bào)告基因的相對熒光素酶活性，而對突變型報(bào)告基因的相對熒光素酶活性無影響。本研究結(jié)果顯示，觀察組YKL-40 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于對照組，說明上調(diào)miR-214表達(dá)可明顯抑制YKL-40表達(dá)水平。上述結(jié)果提示，miR-214以完全配對的方式結(jié)合YKL-40 mRNA 的3′-UTR序列，且miR-214對靶基因YKL-40的表達(dá)具有重要的調(diào)控效應(yīng)。

YKL-40是一種細(xì)胞因子，可參與多種免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展，如選擇性IgA缺乏癥、慢性淋巴細(xì)胞性白血病及淋巴瘤等[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)，干擾YKL-40表達(dá)可延緩慢性淋巴細(xì)胞性白血病的進(jìn)展[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，YKL-40在正常腎組織中表達(dá)降低，并具有抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siYKL-40的LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖抑制率明顯高于轉(zhuǎn)染negative control的細(xì)胞；說明干擾YKL-40表達(dá)同樣可降低LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖，其作用與過表達(dá)miR-214一致。以上結(jié)果提示，miR-214可能通過介導(dǎo)YKL-40而調(diào)控腎小球系膜細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與LN的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，LN小鼠腎小球系膜細(xì)胞miR-214表達(dá)降低，其可能通過下調(diào)YKL-40表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖。miR-214有望成為LN診斷和治療的新分子標(biāo)志物，亦可能作為LN基因治療的一個有效靶點(diǎn)，但是其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of microRNA-214 on proliferation of mouse mesangial cells with lupus nephritis

YAOFeifei,SUNLiqiu,FANGWei,WANGHuamin,YAODongsheng,CUIRui,XUJia,WANGLi,WANGXiumei

(FourthHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To investigate the effect and molecular mechanism of microRNA-214 (miR-214) on the proliferation of mouse mesangial cells with lupus nephritis (LN). Methods The MRL-Faslpr/JNju mice (LN mice,n=20) and wild-type mice (n=20) were sacrificed and the glomerular mesangial cells were isolated and cultured. The relative expression of miR-214 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The glomerular mesangial cells in the logarithmic phase were randomly divided into two groups, which were separately transfected by MiR-214 mimics (observation group) and NC mimics control (control group). The inhibitory rate of proliferation of mouse mesangial cells was detected by MTT. The target gene of miR-214 was predicted by bioinformatics analysis and verified by dual luciferase reporter assay. Furthermore, the mRNA and protein expression levels of YKL-40 were examined by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. LN mouse mesangial cells in the logarithmic phase were selected and then were transfected with siYKL-40 and negative control, respectively, and the inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT assay. Results The expression of miR-214 in the mouse mesangial cells of LN group was 0.35±0.09, which was significantly down-regulated as compared with that of the control group (1) (P<0.01). The expression of miR-214 in the miR-214 mimics group and NC mimics control group was 85.54±12.07 and 1 (P<0.01). The inhibitory rate of proliferation in the observation group was higher than that of the control group on day 1, 2 and 3 (P<0.05 orP<0.01). Compared with the control group, the relative expression of YKL-40 mRNA and protein decreased in the observation group (allP<0.05). Compared with that transfected with negative control, the proliferation inhibition rate of glomerular mesangial cells in the LN mice transfected with siYKL-40 increased (P<0.05 orP<0.01). Conclusions The expression of miR-214 is down-regulated in LN mouse mesangial cells. Up-regulation of miR-214 expression inhibits the proliferation of mouse mesangial cells, which may be mediated by YKL-40 down-regulation.

lupus nephritis; microRNA-214; mesangial cells; proliferation; YKL-40; mice

黑龍江省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目(QC2010094)。

姚菲菲(1980-)，女，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟I臟病學(xué)基礎(chǔ)與臨床。E-mail： yaofeifeidoctor@sina.com

王秀梅(1962-)，女，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟I臟病學(xué)基礎(chǔ)與臨床。E-mail： wxmhaerbing2010@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.48.005

R593.2424

A

1002-266X(2016)48-0016-04

2015-12-24)