蕉芋多糖抗氧化性及還原能力的研究

李粉玲，林 瑤

（韓山師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東潮州 521041）

蕉芋多糖抗氧化性及還原能力的研究

李粉玲，林 瑤

（韓山師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東潮州 521041）

以蕉芋地上部分莖葉為原料，采用超聲波輔助熱水提取并精制蕉芋多糖，通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法研究蕉芋多糖的抗氧化性對超氧自由基、羥基自由基的清除作用，采用分光光度法測定不同濃度的蕉芋多糖溶液對亞硝酸鈉的清除能力.研究結(jié)果表明，蕉芋多糖對超氧自由基和羥基自由基具有良好的清除能力，同時對亞硝酸鈉也有一定的清除能力.

蕉芋；多糖；超聲波；羥自由基；超氧陰離子；抗氧化性

蕉芋（Canna edulis Ker Gawl）別名畬鵝草，屬于美人蕉科植物，具塊狀根莖，原產(chǎn)印度群島、南美洲，中國南部及西南部有栽培，始載于《中國經(jīng)濟植物志》.據(jù)潮州鳳凰鎮(zhèn)民間驗方，蕉芋味甘、淡，性涼，入肺、肝、大腸三經(jīng)，具有清熱利濕、解毒消腫、健脾胃功效[1].

在潮州鳳凰鎮(zhèn)，蕉芋塊莖可煮食或提取淀粉，其淀粉是鳳凰鎮(zhèn)特色美食畬鵝粉的主要原料.本實驗通過超聲波輔助熱水提取蕉芋莖葉中的多糖，通過鄰苯三酚自氧化法、水楊酸法[2-4]分別測定蕉芋多糖清除超氧陰離子自由基（O2-·）和羥基自由基（·OH），通過鐵氰化鉀法測定不同濃度蕉芋多糖溶液的還原能力，通過分光光度法測定不同濃度蕉芋多糖溶液對亞硝酸鈉的清除能力，初步評價蕉芋莖葉多糖的抗氧化活性，為蕉芋的綜合利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

蕉芋莖葉，采自潮州鳳凰鎮(zhèn)鳳凰山當(dāng)?shù)亟队蠓N植戶.

1.2 主要試劑

95%乙醇、無水乙醇、丙酮、無水乙醚、5%苯酚、葡萄糖、三氯甲烷（氯仿）、正丁醇、濃硫酸、高嶺土、鄰苯三酚（焦性沒食子酸）、硫酸亞鐵、水楊酸、鹽酸、30%過氧化氫、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、亞硝酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸，均為國產(chǎn)分析純.

1.3 儀器與設(shè)備

KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004N精科電子分析天平（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；752S紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TDL80-2B型離心機（廣州廣一科學(xué)儀器有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；DJ-10A傾倒式粉碎機（上海定久中藥機械制造有限公司）；101-1A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海協(xié)達(dá)計控設(shè)備公司通州醫(yī)科儀器廠）；玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；ET-Q型氣浴恒溫振蕩器（常州榮冠實驗分析儀器廠）.

1.4 實驗內(nèi)容與方法

1.4.1 蕉芋多糖的制備

預(yù)處理：原料蕉芋→電熱鼓風(fēng)干燥箱→傾倒式粉碎機→蕉芋粉末（過40目篩）.

10 g蕉芋粉末→索氏提取器→石油醚回流脫脂2次→無水乙醇回流脫脂2次（回流時間1 h/次，試劑用量60 mL/次）→烘干恒重（提取率為93.40%）.

粗多糖的制備[5-7]：碘量瓶（蕉芋粉末∶去離子水質(zhì)量比為1∶5）→超聲波清洗儀二次浸提20 min（溫度60℃、超聲波功率50%、料液比1∶30）→減壓抽濾→調(diào)溫電熱套（加熱濃縮至1～2 mL）→趁熱加入為濃縮液4倍體積的95%乙醇，置4℃冰箱過夜→離心收集其沉淀，沉淀物依次用95%乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌→真空干燥得粗多糖.

粗多糖精制：粗多糖用50 ml蒸餾水溶解，加入Sevage試劑脫蛋白[8-9]（多糖溶液∶氯仿∶正丁醇=1∶0.2∶0.04）→振蕩30 min，靜置→加入適量高嶺土脫色20 min，重復(fù)多次→加4倍量95%乙醇，置4℃冰箱過夜→離心收集沉淀，用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌沉淀→真空干燥得精多糖.

1.4.2 蕉芋多糖抗氧化性及還原能力的測定

（1）蕉芋多糖對超氧陰離子自由基（O2-·）清除能力的測定

實驗原理：

采用改進(jìn)的鄰苯三酚自氧化法[10-11]：在堿性條件（pH 8.2）下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成O2-·和有色中間產(chǎn)物，該有色物在波長325 nm處有一特征吸收峰.當(dāng)加入O2-·清除劑時，O2-·的生成受到抑制，鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)受阻，溶液在波長325 nm處吸收峰減小.所以通過測定A325，可以計算蕉芋多糖對O2-·的清除作用.

實驗步驟：

將50 mmol/LTris-HC1緩沖溶液（pH 8.2）4.5 mL與4.2 mL蒸餾水混勻，于25℃水浴中保持20 min后立即加入5 mmol/L鄰苯三酚（25℃預(yù)熱）0.3 mL，混勻，在4 min內(nèi)，每隔30 s測定OD325，計算鄰苯三酚溶液的吸光值隨時間的變化率Ko.準(zhǔn)確地將蕉芋多糖配成1.0 mg/mL，用蒸餾水將該溶液稀釋成6種濃度：0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL，將1.0 mL不同濃度的蕉芋多糖與3.2 mL蒸餾水混勻，按上述步驟和條件測定添加樣品的鄰苯三酚溶液在325 nm處吸光值，計算其吸光值（Kx）隨時間的變化.

計算方法：

超氧陰離子自由基清除率的計算公式為

其中Ko為空白的平均吸光值，Kx為試樣的平均吸光值

（2）蕉芋多糖對羥自由基（·OH）清除能力的測定

實驗原理：

采用水楊酸法[12-14]Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，H2O2與2價鐵離子混合后產(chǎn)生OH-，其反應(yīng)方程式為：H2O2+Fe2+=OH-+·OH+Fe3+.OH-具有很高的反應(yīng)活性，存活時間短，但在反應(yīng)體系中加入水楊酸，捕捉·OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在510 nm處有強吸收.若加入具有清除·OH功能的被測物，便會與水楊酸競爭·OH，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少.采用固定反應(yīng)時間法，在510 nm處測量含被測物反應(yīng)液的吸光度，并與空白液比較，便能測定被測物對·OH的清除作用.

實驗步驟：

準(zhǔn)確地將蕉芋多糖配成1.0 mg/mL，用蒸餾水將該溶液稀釋成6種濃度：0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL.取上述不同濃度多糖溶液各1 mL，再加入9 mmol/L FeS041 mL、9 mmol/L水楊酸—乙醇1 mL，最后加入8.8 mmol/L H2021 mL啟動反應(yīng)，測定OD510，每個濃度重復(fù)三次，取吸光度的平均值.

計算方法：

其中，Ao為不加入蕉芋多糖溶液的空白對照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸—乙醇、過氧化氫；Ax為加入蕉芋多糖后的吸光度值；Axo為不加過氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值.

（3）蕉芋多糖還原能力測定-鐵氰化鉀法

實驗原理：

對于抗氧化劑來說，其抗氧化活性和還原能力之間有著直接的關(guān)系.抗氧化劑主要是通過自身的還原作用從而給出電子以清除自由基，因此，其還原能力越強，則表明其抗氧化活性越強，故可通過測定樣品的還原能力來說明其抗氧化活性的大小[15-16].還原能力的測定是以被測樣品是否為一良好的電子供應(yīng)者為指標(biāo)的，其供應(yīng)的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基反應(yīng)，使自由基生成較惰性更為穩(wěn)定的物質(zhì)，以中斷自氧化連鎖反應(yīng)，同時，還原能力可能與樣品分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其分子的未共用電子對越多，還原能力越強.

實驗步驟：

分別取0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、1 mg/mL的多糖樣品溶液1 mL加入pH6.6的磷酸緩沖溶液和1%K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL并混合均勻，混合液在50℃下保溫20 min之后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，吸取此溶液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%FeC13，混合均勻，30 min后于700 nm波長處測定吸光度.

（4）蕉芋多糖對亞硝酸鈉清除率的測定-分光光度計法

實驗原理：

亞硝酸鹽在弱酸性的條件下，與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽偶合生成紅色絡(luò)合物，用分光光度計測出該化合物的吸光值，就可知道反應(yīng)液中亞硝酸鹽含量多少[17-19].根據(jù)這一原理比較同一條件下亞硝酸鹽含量的多少來反映蕉芋多糖清除亞硝酸鹽能力的大小，亞硝酸鹽含量少，清除能力就強，反之則弱.

實驗步驟：

分別取0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的多糖樣品溶液1 mL加入5.0 mg/L的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL于7支25 mL比色管中37℃恒溫反應(yīng)20 min.加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%的對氨基苯磺酸2.0 mL搖勻，靜置5 min后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min后，在確定的最大吸收波長λmax=540 nm處測定吸光值A(chǔ)，同時用相應(yīng)的浸提劑（即去離子水代替蕉芋多糖溶液）做空白實驗（Ao）,實驗平均三次.

計算方法：

2 結(jié)果與分析

2.1 蕉芋多糖對O2-·的清除率

本實驗利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)測定多糖對其產(chǎn)生的O2-·清除作用，在堿性條件下，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，當(dāng)體系中加入O2-·清除劑后，清除O2-·，阻止中間產(chǎn)物的積累，吸光度降低由于鄰苯三酚自氧化反應(yīng)機制復(fù)雜，至今尚未研究清楚，無法以精確的反應(yīng)速率方程描述其反應(yīng)過程，只能根據(jù)反應(yīng)開始后各反應(yīng)液的K值變化來對其反應(yīng)進(jìn)行分析.

圖1 不同蕉芋多糖濃度對O2-·清除率的影響

由圖1可以看出，蕉芋多糖對O2-·在0.1 mg/mL～0.6 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出量效關(guān)系，其對O2-·的抑制率是隨著濃度的增加而遞增的.0.6 mg/mL～1.0 mg/mL的實驗濃度范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定.

2.2 蕉芋多糖對（·OH）的清除效果

羥基自由基的化學(xué)性質(zhì)非常活潑，可損傷蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等多種生物大分子，尤其對脂質(zhì)過氧化的作用最強.蕉芋多糖對羥基自由基的清除率參見圖2.

羥自由基是生物體內(nèi)最為活潑的活性氧.圖2顯示，蕉芋多糖對Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用，在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)其抑制率隨濃度不斷上升，在濃度為1 mg/mL時對Fenton體系產(chǎn)生的·OH清除率達(dá)34.11%.

3.3 蕉芋多糖的還原能力

在試驗濃度范圍內(nèi)，還原力測試混合液的吸光值隨著濃度的增加而增大，見圖3.

由圖3可以看出，在0.1 mg/ mL～1.0 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)，隨著蕉芋多糖溶液濃度增加，其還原能力不斷增強.

3.4 蕉芋多糖對亞硝酸鈉的清除率

由圖4可知蕉芋多糖對NaNO2的清除率隨蕉芋多糖濃度的增加而增加，當(dāng)試驗體系中加入的蕉芋多糖濃度達(dá)到0.4 mg/mL時再增加用量時，其對NaNO2的清除率增長比較快.在濃度達(dá)到1.2 mg/mL，蕉芋多糖溶液對NaNO2的清除率可達(dá)22.13%，說明蕉芋多糖對亞硝酸鈉有一定的清除能力.

圖2 不同多糖濃度對（·OH）清除率的影響

圖3 不同濃度的蕉芋多糖溶液的還原能力

圖4 蕉芋多糖溶液的濃度對亞硝酸鈉的清除率的影響

4 結(jié)論

本實驗對蕉芋多糖抗氧化性進(jìn)行測定，得出了蕉芋多糖對超氧自由基和羥基自由基具有良好的清除能力，在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL實驗濃度范圍內(nèi)，隨著蕉芋多糖溶液濃度增加，清除能力增強，兩者之間存在著量效關(guān)系，對超氧自由基的清除率最大可達(dá)39.5%.

亞硝酸鹽與仲胺在人體和動物體內(nèi)均能合成亞硝胺，尤其在人和動物的胃中更適于合成亞硝胺[19].因此，阻斷亞硝胺合成或消除亞硝胺的前體是防治癌病因產(chǎn)生的有效途徑之一.在模擬人體胃液條件下，用超聲輔助提取的蕉芋多糖提取液，進(jìn)行清除亞硝酸鈉的實驗，在一定的多糖濃度范圍內(nèi)，清除率隨多糖量的增加而增加，清除率最大可達(dá)22.13%.因此，蕉芋保健品有助于清除體內(nèi)亞硝酸鹽，對防治癌癥病因具有更重要的開發(fā)價值.

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A Study of the Polysaccharides of Canna edulis Kei Gawl,Its Resistance to Oxidation,and Reduction

LI Fen-ling，LIN Yao
（College of Chemistry and Environmental Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou，Guangdong,521041）

With extraction and purification of polysaccharides by way of ultrasoni-aided hot water,using part of the stem leaf on the ground of the Canna edulis Ker Gawl,through the adjacent phenyl phenol three from oxidation,and salicylic acid method,this paper studies the oxidation resistance of polysaccharides on the super oxygen free radical,hydroxyl free radical scavenging effect,and the sodium nitrite removal by different quantity of polysaccharide by spectrophotometric method.Research results show that Canna edulis Ker Gawl polysaccharide has good removal effect on the super oxygen free radical and hydroxyl free radical,and can effectively block the synthesis of nitrosamines.Meanwhile and it also has a certain ability to remove sodium nitrite.

Canna edulis Ker Gawl;polysaccharide;ultrasonic;hydroxyl radical;superoxide anion;oxidation resistance

TS 202.3

：A

：1007-6883（2016）06-0029-05

責(zé)任編輯 朱本華 周春娟

2016-03-22

李粉玲（1970-），女，廣東汕頭人，韓山師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院高級實驗師.