人誘導多能干細胞重編程過程中長鏈非編碼RNA的差異表達研究

俞茜，劉雅麗，范勇

人誘導多能干細胞重編程過程中長鏈非編碼RNA的差異表達研究

俞茜，劉雅麗，范勇△

摘要：目的探討人誘導多能干細胞重編程過程中長鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達改變及其作用。方法利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片檢測人體細胞、誘導多能干細胞以及胚胎干細胞中lncRNA的表達情況。通過數據分析比較人體細胞誘導為多能干細胞后lncRNA的差異表達，篩選出在重編程過程中可能發揮作用的lncRNA。結果人誘導多能干細胞lncRNA表達譜類似于胚胎干細胞而與體細胞不同。通過聚類分析發現誘導多能干細胞與體細胞之間有3 156個差異表達lncRNA。通過生物學分析發現人體細胞誘導為多能干細胞重編程過程中有222個差異表達的lncRNA。結論lncRNA在人誘導多能干細胞重編程過程中可能發揮著重要的作用。

關鍵詞：多能干細胞；核重編程；芯片分析技術；長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200個核苷酸、不編碼蛋白質的非編碼RNA［1］。起初該類RNA被認為是轉錄垃圾或者是RNA聚合酶Ⅱ雜亂行為［2］。而近年來的研究表明，lncRNA在細胞生物、生理、病理過程中扮演著重要的角色，參與調節細胞的生長、分化、代謝以及凋亡［3］。lncRNA與腫瘤的發生發展有著不一樣的關系，它們通過參與基因的表達調控或促進或抑制腫瘤的發展［4-5］。lncRNA在小鼠胚胎干細胞的分化過程中表現出表達差異性［6］，同時多種多能性相關轉錄因子也對其進行調控［7］。另一方面，lncRNA也參與調節多種成體干細胞的自我更新以及分化能力［8］，lncRNAs Xist就在造血干細胞長期生存中發揮著不可替代的作用［9］。

誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）是將轉錄因子體外轉入到分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種多能性細胞狀態［10］。分子表觀遺傳修飾分析表明，在細胞重組期間，幾乎重構了整個表觀基因組，最終獲得與胚胎干細胞非常類似的蛋白表達以及miRNA基因表達譜的多能干細胞［11-12］。目前對細胞重編程過程尤其是誘導多能干細胞過程中lncRNA的研究還非常有限。有研究發現，在重編程過程以及小鼠和人類的胚胎干細胞中存在特異性的 lncRNA，這些lncRNAs與重編程重要因子OCT4、NANOG以及SOX2表達有很大相關性［6］。lncRNA會影響細胞的重編程過程，重編程調節lncRNA（lncRNA-ROR）是一種發揮了重要調控作用的重編程編碼調控器，抑制他們的表達會降低細胞的重編程效率［13-14］。但是lncRNA在這期間的變化還不是很明確。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81370766）

作者單位：廣州，廣州醫科大學附屬第三醫院，廣東省產科重大疾病重點實驗室（郵編510150）

作者簡介：俞茜（1990），女，碩士在讀，主要從事干細胞與生殖方面的研究

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通訊作者E-mail：yongfan011@gzhmu.edu.cn

本研究利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片，比較重編程前后人體細胞和誘導多能干細胞之間lncRNA的表達差異，獲得在重編程過程中差異表達lncRNA，通過生物信息學分析找出可能在重編程過程中發揮重要作用的lncRNA。

1　材料與方法

1.1材料本研究使用的A966、17-17、ips-G、ips-A966-9、ips-A966-11、hES10細胞系均來自本實驗室前期自主建系，建系方法詳見之前的實驗工作［15］。其中A966為羊水細胞，ips-A966-9、ips-A966-11為由A966誘導而來的誘導多能干細胞。17-17為皮膚成纖維細胞，ips-G為由17-17誘導而來的誘導多能干細胞。hES10為胚胎干細胞。

1.2方法

1.2.1細胞培養方法羊水細胞的培養液為商品化的AmnioMAX-TM-II（GIBCO）培養基。皮膚成纖維細胞的培養基為含高糖的 DMEM培養基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，Invitrogen），添加10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%雙抗（青霉素/鏈霉素，Pen/Strep）。人誘導多能干細胞以及胚胎干細胞培養在鋪有matrigel的培養皿上，用mTeSR1培養基培養，每天換液至可細胞傳代或可收集。細胞每4～5 d用EDTA消化傳代。所有細胞均培養在37℃，5%CO2培養箱中。

1.2.2總RNA提取當細胞長到80%的密度時，收集細胞使用 mirVanaTM RNA Isolation Kit（Applied Biosystem p/n AM1556）提取Total RNA，詳細步驟參見使用說明書。

1.2.3獲取cRNA用于芯片分析按照步驟進行以下實驗，提取的總RNA的純化（QIAGEN RNeasy?Mini Kit），cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成，熒光標記cRNA合成，cRNA純化（QIAGEN RNeasy?Mini Kit），cRNA濃度測定，cRNA樣品片段化和芯片雜交（4×180K microarrays），芯片洗滌，Agilent掃描儀中掃描。詳細步驟參照Agilent芯片分析方法要求。

1.2.4分析數據及作圖軟件利用Agilent Human lncRNA （4×180K）芯片對2株人體細胞系、3株人誘導多能干細胞系以及1株人胚胎干細胞系進行lncRNA表達譜芯片檢測，以了解lncRNA在人體細胞重編程過程中的變化。對人體細胞、誘導多能干細胞與胚胎干細胞之間表達差異的lncRNA進行了進一步整合分析。Feature Extraction軟件讀取數據Scan resolution 5 μm，PMT 100%，采用Feature Extraction進行處理分析。最后應用GENESPRING12.0進行分位數標準化（Quantile normalization）。

2　結果

2.1各細胞系主成分分析（PCA）及基因表達譜聚類分析主成分分析結果顯示，體細胞羊水細胞A966與皮膚成纖維細胞17-17成分類似，而由其誘導而來的誘導多能干細胞ips-A966-9、ips-A966-11、ips-G則與胚胎干細胞hES10類似，見圖1A。通過Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片結果聚類分析發現人體細胞與誘導多能干細胞之間存在4 031個基因的差異表達（表達差異大于2倍）。基因表達譜聚類分析顯示，3株人誘導多能干細胞系在基因表達方面更類似于胚胎干細胞而與其對應的體細胞不同，見圖1B。

2.2人體細胞與誘導多能干細胞之間lncRNA表達譜聚類分析表達譜聚類分析結果顯示，人體細胞與誘導多能干細胞之間存在3 156個lncRNA的差異表達。3株人誘導多能干細胞在lncRNA表達譜方面類似于人胚胎干細胞而與人體細胞不同，見圖2。

2.3人體細胞誘導為多能干細胞重編程過程中lncRNA表達差異分析整合分析結果顯示，ips-A966-9、ips-A966-11與A966有6 965個lncRNA差異表達，ips-G與17-17有7 929個lncRNA差異表達，ips-A966-9、ips-A966-11和ips-G與hES10共有1 038個lncRNA差異表達。為了進一步篩選出可能與重編程有關的lncRNA，筆者分析得出ips 與hES10，ips-A966-9、ips-A966-11與A966，ips-G 與17-17之間的差異表達lncRNA，最后取三者共有的差異lncRNA并取交集，結果顯示3對共有222個差異表達的lncRNA，見圖3。這些差異表達的lncRNA在維持干細胞多能性及誘導體細胞重編程過程中可能發揮重要作用。

3　討論

哺乳動物基因組編碼大量的lncRNA，但大部分lncRNA的功能目前為止還不是特別明確。已有研究表明，lncRNAs在維持胚胎干細胞的多能性方面發揮著重要作用，且它們通過與核蛋白相互作用來發揮生物學功能［13］。重編程是在體細胞里過表達相關多能性基因使其轉變成類似于胚胎干細胞的過程。在這個過程中，基因表達發生了很大的變化，與此同時，lncRNA是否會發生變化呢？筆者利用Agilent Human lncRNA（4×180K）芯片比較人體細胞重編程為誘導多能干細胞后lncRNA的表達譜變化。為了確定各樣本之間的聯系以及實驗的合理性，筆者對在本研究用到的細胞系進行主成分分析。發現人體細胞重編程為誘導多能干細胞后，lncRNA的表達發生了巨大變化。基因表達譜結果證實本研究使用的人誘導多能干細胞在基因表達方面表現出與胚胎干細胞相似的特性。lncRNA聚類分析顯示誘導多能干細胞與誘導前的體細胞間lncRNA是有表達差異的，誘導多能干細胞的lncRNA表達更類似于胚胎干細胞。通過生物信息學分析發現，在誘導多能干細胞與體細胞和胚胎干細胞的差異比較中有222個lncRNA的共有差異表達，這從側面反映了lncRNA可能在重編程過程中發揮重要作用。

本研究通過芯片數據分析得出lncRNA在重編程過程中表達是有發生變化的，但其是通過什么來作用以及怎么發揮作用的還不明確。已有研究表明，在建立以及維持多能性方面，染色質重塑復合物起著至關重要的作用，而大量的lncRNA能夠通過與染色質重塑復合物相互作用來調控目標基因的表達［16-18］。本研究分析得出的人體細胞重編程為誘導多能干細胞差異表達lncRNA為進一步研究其在干細胞多能性基因調控網絡中的作用提供了新的思路。

致謝：感謝上海歐易生物醫學科技有限公司在芯片數據分析方面提供的幫助。

（圖1～3見插頁）

參考文獻

［1］Okazaki Y，Furuno M，Kasukawa T，et al.Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60，770 full-length cDNAs［J］.Nature，2002，420（6915）：563-573.

［2］van Bakel H，Nislow C，Blencowe BJ，et al.Most“dark matter”transcripts are associated with known genes［J］.PLoS Biol，2010，8 （5）：e1000371.doi：10.1371/journal.pbio.1000371.

［3］Mathieu EL，Belhocine M，Dao LT，et al.Functions of lncRNA in development and diseases［J］.Med Sci（Paris），2014，30（8/9）：790-796.doi：10.1051/medsci/20143008018.

［4］Wang Y，Liu XJ，Yao XD.Function of PCA3 in prostate tissue and clinical research progress on developing a PCA3 score［J］.Chin J Cancer Res，2014，26（4）：493-500.doi：10.3978/j.issn.1000-9604.

［5］Luo J，Tang L，Zhang J，et al.Long non-coding RNA CARLo-5 is a negative prognostic factor and exhibits tumor pro-oncogenic activity in non-small cell lung cancer［J］.Tumour Biol，2014，35 （11）：11541-11549.doi：10.1007/s13277-014-2442-7.

［6］Dinger ME，Amaral PP，Mercer TR，et al.Long noncoding RNAs in mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation［J］. GenomeRes，2008，18（9）：1433-1445.doi：10.1101/ gr.078378.108.

［7］Eades G，Zhang YS，Li QL，et al.Long non-coding RNAs in stem cells and cancer［J］.World J Clin Oncol，2014，5（2）：134-141. doi：10.5306/wjco.v5.i2.134.

［8］Ramos AD，Diaz A，Nellore A，et al.Integration of genome-wide approaches identifies lncRNAs of adult neural stem cells and their progeny in vivo［J］.Cell Stem Cell，2013，12（5）：616-628.doi：10.1016/j.stem.2013.03.003.

［9］Yildirim E，Kirby JE，Brown DE，et al.Xist RNA is a potent suppressor of hematologic cancer in mice［J］.Cell，2013，152（4）：727-742.doi：10.1016/j.cell.2013.01.034.

［10］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131（5）：861-872.

［11］Chin MH，Mason MJ，Xie W，et al.Induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells are distinguished by gene expression signatures［J］.Cell Stem Cell，2009，5（1）：111-123.doi：10.1016/j. stem.2009.06.008.

［12］Ball MP，Li JB，Gao Y，et al.Targeted and genome-scale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells［J］.Nat Biotechnol，2009，27（4）：361-368.doi：10.1038/nbt.1533.

［13］Guttman M，Donaghey J，Carey BW，et al.lincRNAs act in the circuitry controlling pluripotency and differentiation［J］.Nature，2011，477（7364）：295-300.doi：10.1038/nature10398.

［14］Loewer S，Cabili MN，Guttman M，et al.Large intergenic noncoding RNA-RoR modulates reprogramming of human induced pluripotent stem cells［J］.Nat Genet，2010，42（12）：1113-1117. doi：10.1038/ng.710.

［15］Kang X，Yu Q，Huang Y，et al.Effects of integrating and nonintegrating reprogramming methods on copy number variation and genomic stability of human induced pluripotent stem cells［J］.PLoS One，2015，10（7）：e0131128.doi：10.1371/journal.pone.0131128.

［16］Rinn JL，Kertesz M，Wang JK，et al.Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs［J］.Cell，2007，129（7）：1311-1323.

［17］Zhao J，Sun BK，Erwin JA，et al.Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome［J］.Science，2008，322（5902）：750-756.doi：10.1126/science.1163045.

［18］Khalil AM，Guttman M，Huarte M，et al.Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（28）：11667-11672.doi：10.1073/pnas.0904715106.

（2016-03-09收稿2016-04-17修回）

（本文編輯魏杰）

中圖分類號：Q28

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20160135

Studies on the long non-coding RNA during the reprogramming of human pluripotent stem cells

YU Qian,LIU Yali,FAN Yong△
Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China
△Corresponding AuthorE-mail:yongfan011@gzhmu.edu.cn

Abstract:ObjectiveTo investigate the changes and roles of the long non-coding RNA（IncRNA）during the reprogramming of human induced pluripotent stem cells.MethodsAgilent Human lncRNA(4×180K)chip was used to check the expression of lncRNA in somatic cells,induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.Compared with differentially expressed lncRNA in somatic cells and induced pluripotent stem cells,lncRNA was selected that may play an important role during the reprogramming of human pluripotent stem cells.ResultsThe lncRNA expression profiles in induced pluripotent stem cells were similar to embryonic stem cells,but were different from the somatic cells.A total of 3 156 differentially expressed lncRNAs were found between stem cells and somatic cells by cluster analysis,and 222 differentially expressed lncRNAs were found during the reprogramming process of human pluripotent stem cells by biological analysis.ConclusionlncRNA may play an important role in reprogramming process of human pluripotent stem.

Key words:multipotent stem cells;nuclear reprogramming;microchip analytical procedures;long non-coding RNA