溫泉水中嗜肺軍團(tuán)菌污染調(diào)查及分子分型研究

章樂(lè)怡,李 毅,上官智慧,吳躍進(jìn),謝愛(ài)蓉,王良懷,陳文斌

溫泉水中嗜肺軍團(tuán)菌污染調(diào)查及分子分型研究

章樂(lè)怡1,李 毅1,上官智慧1,吳躍進(jìn)1,謝愛(ài)蓉1,王良懷1,陳文斌2

目的 探討溫泉水環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌的污染狀況和分布規(guī)律，了解其主要血清型別及基因型別。方法采取隨機(jī)抽樣方法采集溫泉場(chǎng)所蓄水池、溫泉池、客房淋浴水等，濃縮后用細(xì)菌培養(yǎng)法分離得到可疑菌株，用血清學(xué)與熒光定量 PCR技術(shù)進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的鑒定。對(duì)分離的菌株用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分型方法(SBT)進(jìn)行基因分型。結(jié)果65份溫泉水中35份檢出嗜肺軍團(tuán)菌，檢出率為53.85%。嗜肺軍團(tuán)菌計(jì)數(shù)范圍在20 CFU/100 mL-16 000 CFU/100 mL之間。血清分型以L(fǎng)P1、LP3為主。分離的嗜肺軍團(tuán)菌菌株均攜帶dot基因。對(duì)40株嗜肺軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行了PFGE聚類(lèi)分析，得到10種不同的帶型。40株菌株13種ST型可以被分為3個(gè)克隆群和1個(gè)單態(tài)群。結(jié)論本地區(qū)溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌污染程度較高，分子分型結(jié)果表明這些菌株具有遺傳多樣性。

溫泉水；嗜肺軍團(tuán)菌；分子分型；遺傳多樣性

Supported by the Science and Technology Development Program of Wenzhou City(No.Y20150311)

軍團(tuán)菌(Legionella)是一種革蘭陰性桿菌,廣泛存在于自然環(huán)境和人工環(huán)境的水體、土壤中。軍團(tuán)菌病是由軍團(tuán)菌引起的一種以肺炎為主的全身性疾病。嗜肺軍團(tuán)菌是導(dǎo)致軍團(tuán)病最主要的病原體。人類(lèi)對(duì)軍團(tuán)菌普遍易感，人感染軍團(tuán)菌主要是通過(guò)吸入被軍團(tuán)菌污染的氣溶膠而導(dǎo)致[1]。我國(guó)于1982年在南京首次發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌病病例，全國(guó)已有多起軍團(tuán)病的散發(fā)與暴發(fā)、流行報(bào)道[2-4]。

近年來(lái)國(guó)外溫泉水引起的軍團(tuán)菌暴發(fā)事件時(shí)有報(bào)道，旅游獲得型疫情中，以源于溫泉與水療的比例最高。歐洲軍團(tuán)菌感染工作組(EWGLI)2007—2008 年間報(bào)告軍團(tuán)菌疫情中，其中 6 起與噴泉和水療有關(guān)[5]。日本也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道軍團(tuán)菌病例發(fā)生與溫泉水有關(guān)[6]。

國(guó)內(nèi)陸續(xù)有來(lái)自各地對(duì)環(huán)境樣本軍團(tuán)菌監(jiān)測(cè)報(bào)道，大多是來(lái)自集中空調(diào)冷卻塔水、冷凝水的調(diào)查[7-8]，也有淋浴水、管道水、溫泉水、花卉培育土等軍團(tuán)菌污染調(diào)查[9-10]。環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果表明軍團(tuán)菌已成為人們?nèi)粘Ｉ钪型{健康的重要因素。在溫州地區(qū)，對(duì)于冷卻塔水監(jiān)測(cè)是從2009年開(kāi)始的，但是對(duì)于溫泉水系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)處于空白。溫泉風(fēng)景區(qū)是我市的旅游勝地，近些年溫泉文化主題景區(qū)的開(kāi)發(fā)力度較大, 吸引不少省內(nèi)外游客。因此為保證游客健康，在本地區(qū)進(jìn)行溫泉水環(huán)境軍團(tuán)菌污染調(diào)查是有必要的。我們選取本市溫泉景區(qū)4個(gè)溫泉場(chǎng)所作為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，進(jìn)行嗜肺軍團(tuán)菌的調(diào)查和研究, 對(duì)分離出來(lái)的菌株用脈沖腸凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分析(SBT)進(jìn)行分子分型研究。

1 材料與方法

1.1樣本采集 采集本市溫泉風(fēng)景區(qū) 4家溫泉場(chǎng)所(包括溫泉酒店和度假村)的溫泉水，在正常營(yíng)業(yè)期間于每個(gè)場(chǎng)所采水樣，分別在2015年8月、2016年1月、2016年6月3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行，前兩次采樣，每次每家場(chǎng)所隨機(jī)選取5個(gè)點(diǎn)，包括各個(gè)溫泉池水和房間淋浴噴頭的溫泉水。2016年6月除采集溫泉池水和房間淋浴噴頭的溫泉水外，增加采集溫泉泉眼水、各個(gè)溫泉場(chǎng)所的蓄水池水，以滅菌廣口瓶采集水樣500 mL，并記錄水溫，水樣加硫代硫酸鈉中和余氯，當(dāng)日送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2軍團(tuán)菌分離 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行軍團(tuán)菌分離，取200 mL水樣，用孔徑0.45 μm 濾膜經(jīng)抽濾系統(tǒng)集菌后進(jìn)行酸處理，取0.1 mL 處理過(guò)的樣品接種于GVPC平板，置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃孵育10 d，逐日觀察結(jié)果，挑取可疑菌落做初步鑒定。在 BCYE 平板上生長(zhǎng)而在BCYE-cye 平板及血瓊脂平板上不生長(zhǎng)的初步認(rèn)定為軍團(tuán)菌，疑似菌落再進(jìn)行血清學(xué)凝集試驗(yàn)。

1.3熒光定量PCR方法 參照文獻(xiàn)[12-14]的引物和探針，針對(duì)軍團(tuán)菌屬5S rRNA 基因和嗜肺軍團(tuán)菌dot基因保守序列，5S rRNA 探針5′端標(biāo)記HEX，3′端標(biāo)記BHQ；dot基因探針5′端標(biāo)記FAM，3′端標(biāo)記MGB。通過(guò)檢測(cè)這2種基因進(jìn)一步進(jìn)行菌株復(fù)核鑒定。

1.5SBT分型 利用7個(gè)基因測(cè)序?qū)妶F(tuán)菌進(jìn)行SBT分型。選用7種管家基因合成7對(duì)引物，選擇嗜肺軍團(tuán)菌的7個(gè)基因(flaA,pilE,asd,mip,mompS,proAandneuA)作為本研究的目的基因。等位基因的選擇參照EWGLI網(wǎng)站發(fā)布的嗜肺軍團(tuán)菌SBT 標(biāo)準(zhǔn)方法(5.0版本)http://www.hpa-bioinformatics.org.uk/legionella/legionella_sbt/php/sbt_homepage.php。運(yùn)用BioNumerics version 7.5 對(duì)所得嗜肺軍團(tuán)菌ST型別進(jìn)行聚類(lèi)分析，分析其遺傳關(guān)系。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以率、構(gòu)成比為主要指標(biāo)，率的差異比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1溫泉水中嗜肺軍團(tuán)菌檢出情況 共檢測(cè)溫泉水65份，35 份檢出，檢出率為53.85%；夏季檢出率為51.11%(23/45)，冬季檢出率為60%(12/20)，夏季、冬季檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，(χ2=0.44，P>0.05)。嗜肺軍團(tuán)菌計(jì)數(shù)從在 20 CFU/100 mL～16 000 CFU/100 mL之間。其中軍團(tuán)菌含量為10～100 CFU/100 mL)者有18份標(biāo)本 ，軍團(tuán)菌含量為100～1 000 CFU/100 mL者有 11 份標(biāo)本 ，軍團(tuán)菌含量1 000～10 000 CFU/100 mL者有4份標(biāo)本，2份標(biāo)本軍團(tuán)菌含量>10 000 CFU/100 mL。溫泉泉眼沒(méi)有檢出嗜肺軍團(tuán)菌，溫泉池、蓄水池、房間淋浴噴頭的溫泉水檢出率分別是83.33%、42.86%、36.36%。(χ2=12.814，P<0.05)見(jiàn)表1。

表1 溫泉場(chǎng)所不同溫泉點(diǎn)溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌檢出情況

Tab.1 Contamination status of hot spring water from different collecting points

采集地點(diǎn)Samplinglocation陽(yáng)性率(%)Positiverate(%)蓄水池watertank42．86(3/7)溫泉池hotspringpool83．33(20/24)淋浴噴頭shower36．36(12/33)泉眼spring0(0/1)合計(jì)Total53．85%(35/65)

2.2嗜肺軍團(tuán)菌血清型分布情況 從35份軍團(tuán)菌陽(yáng)性的水體中共檢出40株嗜肺軍團(tuán)菌菌株(有5份水樣分別檢出2個(gè)型別的嗜肺軍團(tuán)菌)。其中包含LP1、LP2、LP3、LP13等4種血清型，LP1占檢出菌的37.50%(15/40)、LP3 為45.00%(18/40)，LP2為12.50 %(5/40)，LP13為 5.00%(2/40)。

2.3熒光定量PCR結(jié)果 利用軍團(tuán)菌5S rRNA基因和嗜肺軍團(tuán)菌dot基因的引物，對(duì)40株檢出的軍團(tuán)菌菌株進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果40株軍團(tuán)菌5S rRNA、dot基因均為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為100.00%，5S rRNA是軍團(tuán)菌屬共有基因,高度保守，dot基因來(lái)區(qū)別嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌，dot基因作為嗜肺軍團(tuán)菌一種毒力島基因，與毒力有關(guān)，結(jié)果證明40株菌株均為嗜肺軍團(tuán)菌。

2.4PFGE結(jié)果 對(duì)40株分離株進(jìn)行了PFGE分型，獲得10種不同的帶型，以 LPA16.CN0142 帶型最常見(jiàn)，共13株。溫泉水中帶型一致的有來(lái)自不同的溫泉場(chǎng)所，且同一溫泉中有多種帶型。見(jiàn)圖1。

A代表溫泉池，B代表客房淋浴噴頭，C代表蓄水池，HW1-4表示4個(gè)溫泉場(chǎng)所A：hot spring pool, B：shower room, C：water tank, HW1-4 four hot springs environments圖1 2015-2016年溫泉場(chǎng)所中分離出的40株嗜肺軍團(tuán)菌PFGE聚類(lèi)結(jié)果 Fig.1 Clustering results of patterns obtained by PFGE analysis of 40 Legionella strains from hot springs in 2015-2016

2.5SBT分型結(jié)果 通過(guò)BioNumerics 聚類(lèi)分析， 40株嗜肺軍團(tuán)菌菌株ST型被分為 3 個(gè)克隆群和 1個(gè)單態(tài)群，其中克隆群1 包含 8種ST 型，克隆群2、3 均包括2種ST型。40株菌株分為13種ST型，分別有ST 87、1226、1230、1469，1101等。幾種嗜肺軍團(tuán)菌血清型的 ST型別：15株LP1血清型軍團(tuán)菌被分為7種 ST型，11株LP3 血清型被分為5種ST型，5株LP2血清型分5種ST型。溫泉水中發(fā)現(xiàn)幾種新的ST型，與本地區(qū)其他水中分離菌株相比，溫泉水分離菌株具有更高的多態(tài)性，其中ST87比較常見(jiàn)，在3個(gè)溫泉中都發(fā)現(xiàn)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 溫泉水中不同血清型嗜肺軍團(tuán)菌的克隆群分布

Tab.2 Distribution of clonal groups from 40 SBT profiles for different serotypes of L. pneumpphila isolated in springs

Clonalgroups(CGs)STsserogroupsflaApilEasdmipmompsproAneuANo．ofisolatesCGl(n=21)1469LP3261739111131101LP1661539141122196LP1，LP2，LP13661534141142198LP2610157174312201LP11761539141112203LP1，LP36615394362204LP1，LP366153441332205LP217101571714111CG2(n=14)87LP321032894138961LP1，LP3210328914116CG3(n=2)2197LP235171411812199LP27517143281Singleton(n=3)2202LP12101714211483

最小生成樹(shù)的圓圈表示序列類(lèi)型，每個(gè)圓圈的大小表示在這個(gè)ST型別的分離株數(shù)量, ST周?chē)墓猸h(huán)的顏色表示同一克隆復(fù)合物群。

In the minimum spanning tree, the sequence types (STs) are displayed as circles. The size of each circle indicates the number of isolates within this particular type, the colors of halo surrounding the STs denote types that belong to the same clonal group.

圖2 溫泉水中40株嗜肺軍團(tuán)菌最小生成樹(shù)圖

Fig.2 Minimum spanning tree analysis of 40Legionellaisolated from spring water

3 討 論

本研究表明本市溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌檢出情況不容樂(lè)觀，分別于3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行采樣，前兩次是隨機(jī)采取各溫泉場(chǎng)所的溫泉池及房間淋浴噴頭溫泉水。檢測(cè)結(jié)果表明嗜肺軍團(tuán)菌檢出率一直居高不下，最后一次進(jìn)行污染源的調(diào)查，從溫泉泉眼著手，采集泉眼水、每個(gè)溫泉場(chǎng)所的蓄水池、溫泉池及房間的淋浴噴頭溫泉水。4個(gè)溫泉場(chǎng)所溫泉水來(lái)自同一溫泉泉眼，結(jié)果表明溫泉泉眼水未檢出嗜肺軍團(tuán)菌，3個(gè)溫泉場(chǎng)所的蓄水池均檢出嗜肺軍團(tuán)菌，而溫泉池及客房淋浴的溫泉水都是分別從各場(chǎng)所蓄水池通過(guò)管道流入的。溫泉池及客房淋浴水檢出的嗜肺軍團(tuán)菌的血清型別較蓄水池多，部分檢出和蓄水池相同的型別。蓄水池中均只檢出一種型別的嗜肺軍團(tuán)菌，不排除其他血清型漏檢的可能，部分溫泉池中檢出兩種以上的嗜肺軍團(tuán)菌，這和別的文獻(xiàn)中報(bào)道也是相符的[10]。溫泉水檢出的嗜肺軍團(tuán)菌中以L(fǎng)P1型和LP3型為多，LP1和LP3型是引起軍團(tuán)菌病的兩個(gè)主要的血清型。

溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌計(jì)數(shù)表明有6份溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌計(jì)數(shù)超過(guò)1 000 CFU/100 mL ，其中2份高于10 000 CFU/100 mL。根據(jù)文獻(xiàn)，在歐洲一些國(guó)家，當(dāng)水體中嗜肺軍團(tuán)菌數(shù)量>100 CFU/100 mL時(shí)，就必須對(duì)這種水體進(jìn)行消毒處理[17]。雖然到目前為止，對(duì)軍團(tuán)菌感染劑量還沒(méi)有精確的定義，但數(shù)據(jù)表明，在軍團(tuán)菌水污染達(dá)102-104CFU/100 mL時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致散發(fā)病例，當(dāng)數(shù)值超過(guò)104CFU /100 mL可能會(huì)引起軍團(tuán)菌暴發(fā)[18-20]。而我們的溫泉水計(jì)數(shù)最高的2份水樣中的嗜肺軍團(tuán)菌幾乎到達(dá)文獻(xiàn)中軍團(tuán)菌病暴發(fā)的一個(gè)值。雖然目前在中國(guó)2011年旅游行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《溫泉企業(yè)服務(wù)質(zhì)量等級(jí)劃分與評(píng)定》LB/T 016-2011[21]里規(guī)定溫泉水不得檢出嗜肺軍團(tuán)菌，但沒(méi)有定量限值，且沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，表明溫泉水行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步完善。

PFGE結(jié)果表明，幾個(gè)溫泉場(chǎng)所的的溫泉水各自的軍團(tuán)菌PFGE帶型多樣化，但大多數(shù)菌株相似度達(dá)87.0%以上，同一溫泉場(chǎng)所中不同地點(diǎn)的溫泉水有幾種帶型存在。溫泉場(chǎng)所1的蓄水池與溫泉池中菌株血清型不同，但PFGE分析菌株相似度達(dá) 94.1%；溫泉場(chǎng)所3的蓄水池與部分房間淋浴水、溫泉池檢出的菌株帶型一致，但部分血清型不一致；溫泉場(chǎng)所4的蓄水池與部分溫泉池檢出的菌株帶型一致。說(shuō)明這些菌株是相關(guān)聯(lián)的。由于溫泉蓄水池沒(méi)定期清洗，嗜肺軍團(tuán)菌一直在池水中存活，并流到了各個(gè)溫泉池，而在不同的環(huán)境中，部分菌株某些位點(diǎn)發(fā)生了變異。溫泉場(chǎng)所2中的蓄水池沒(méi)有檢出，但在不同的房間淋浴噴頭水里檢出嗜肺軍團(tuán)菌，各個(gè)點(diǎn)分離出的菌株，有完全一致的帶型，也有相似值較低的。故PFGE分型進(jìn)一步證實(shí)各場(chǎng)所溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌污染的環(huán)節(jié)是不同的。除了蓄水池這個(gè)污染環(huán)節(jié)外，還存在某些溫泉池或淋浴管道本身污染的可能。而單純的血清分型不能說(shuō)明軍團(tuán)菌污染來(lái)源。

溫度被認(rèn)為是主要影響軍團(tuán)菌污染的因素[22]。我們?cè)诿糠菟畼硬蓸訒r(shí)均做了水溫記錄，發(fā)現(xiàn)4個(gè)溫泉點(diǎn)的水溫在32 ℃～41 ℃，正是嗜肺軍團(tuán)菌繁殖和存活的適宜溫度。文獻(xiàn)報(bào)道，通常嗜肺軍團(tuán)菌的最適生長(zhǎng)溫度在35 ℃和46 ℃之間[23]。

嗜肺軍團(tuán)菌 SBT分型結(jié)果表明本地區(qū)溫泉水中的嗜肺軍團(tuán)菌具有遺傳多樣性，共分為13種ST型。分離到9種新的ST型(ST2196-2205)，是歐洲數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的ST型，成為目前本地區(qū)嗜肺軍團(tuán)菌的特有型別，另4個(gè)ST型(ST87，ST7、ST114、ST9)以前均在世界多個(gè)國(guó)家引起軍團(tuán)菌病，特別需關(guān)注ST87，在3個(gè)溫泉場(chǎng)所均發(fā)現(xiàn)，血清型為L(zhǎng)P3，與歐洲軍團(tuán)菌數(shù)據(jù)庫(kù)中提交的臨床株血清型一致。溫泉水菌株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ST1型，而本地區(qū)歷年冷卻塔水中檢出的 ST型以ST1型為主，且血清型均是LP1[24]。故遺傳進(jìn)化分析表明本地區(qū)溫泉水中嗜肺軍團(tuán)菌的遺傳特征有別于冷卻水中的嗜肺軍團(tuán)菌。

結(jié)果表明溫泉水嗜肺軍團(tuán)菌污染程度較高，有個(gè)別點(diǎn)已達(dá)到一個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的值，故對(duì)人群的健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，為保護(hù)廣大旅游者的健康，預(yù)防和控制本市軍團(tuán)菌病的發(fā)生，應(yīng)該對(duì)這些溫泉度假村進(jìn)行必要的干預(yù)。

調(diào)查研究結(jié)果向衛(wèi)生部門(mén)提交后，相關(guān)部門(mén)對(duì)溫泉場(chǎng)所進(jìn)行了專(zhuān)項(xiàng)整治，規(guī)范溫泉的衛(wèi)生管理，進(jìn)行徹底清洗消毒，并制定日常消毒管理制度。

(此項(xiàng)研究得到中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所秦天老師、周海健老師、任紅宇老師等幾位專(zhuān)家的大力支持和幫助，在此一并致謝！)

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Contamination status and molecular typing ofLegionellapneumophilain spring environments

ZHANG Le-yi1, Li Yi1, SHANGGUAN Zhi-hui1, WU Yue-jin1,XIE Ai-rong1, WANG Liang-huai1, CHEN Wen-bin2

(1.WenzhouCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325000,China；2.TaishunCenterforDiseaseControlandPrevention,Taishun325500,China)

To research the contamination status and distributive regulation ofLegionellapneumophilain samples from spring water and analyze the main serotypes and genotypes of the pathogen, a stratified sampling method was adopted to collect water samples randomly from water tank, hot spring pool, shower room of hot spring recreations. Suspected strains were isolated from condensed water samples. Serum agglutination assay and real-time PCR technology were used to identifyL.pneumophila. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and sequence-based typing (SBT) were used to describe the genetic polymorphism of the isolates. Overall, 53.85% of water samples showedLegionella-positive, and their concentrations ranged from 20 CFU/100 mL to 16 000 CFU/100 mL. The main serotypes were LP1 type and LP3 type and all strains carrieddotgene. Among them, 40 isolates were analyzed by PFGE by which 10 distinct patterns were differentiated. They were also selected for SBT analysis and divided into 13 different sequence types in 3 main clonal groups belonging to one homomorphic type. Our results demonstrated high prevalence and genetic polymorphism ofLegionellain hot spring recreations of Wenzhou. Hot spring area posed a potential threat to tourists. Spring water of these places should be intervened to prevent occurrence ofLegionnaires' disease.

spring water;Legionellapneumophila; molecular typing; genetic diversity

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.010

1.溫州市疾病預(yù)防控制中心，溫州 325000； 2.泰順縣疾病預(yù)防控制中心，泰順 325500

R378

A

1002-2694(2016)12-1096-06

2016-08-16；

2016-10-28

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.Y20150311)資助