嗜水氣單胞菌雙重熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用

高智玲，紀 雪，郭學軍，陳 萍，劉彥晶，劉 軍，祝令偉，周 偉，馮書章，孫 洋

嗜水氣單胞菌雙重熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應用

高智玲1,2，紀 雪1，郭學軍1，陳 萍2，劉彥晶3，劉 軍1，祝令偉1，周 偉1，馮書章1，孫 洋1

目的 建立快速準確檢測致病性嗜水氣單胞菌的雙重熒光定量PCR方法。方法針對嗜水氣單胞菌的16S rDNA和氣溶素基因aerA的序列設計特異性引物及TaqMan探針，優化雙重熒光定量PCR反應條件，并結合常規PCR方法及分離培養鑒定對臨床樣品進行檢測和對比驗證。結果熒光定量PCR反應體系對質粒標準品的敏感性為10拷貝/反應，是常規PCR檢測方法的100倍；該方法檢測12種其他種屬細菌時未出現假陽性；對實際樣品的檢測結果其敏感性同樣高于普通PCR，定量檢測目的基因的拷貝數與樣品中目的菌的分離率成正比。結論本方法敏感性高，特異性好，可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學研究。

嗜水氣單胞菌；熒光定量PCR；檢測；應用

Supported by the National Science and Technology Major Project of China (No. 2013ZX10004-217-002) and the Scientific and Technological Development Project of Jilin Province (Nos. 20140101032JC and 20150101110 JC) Corresponding author: Sun Yang, Email: sunyang10@hotmail.com

嗜水氣單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，可從水、魚、無脊椎動物、土壤及食物中分離出來，往往與其他疾病關聯而發生繼發性感染[1]。近年來，由于其對人類及水生動物的潛在致病性而備受世界關注。對于人類，嗜水氣單胞菌可以引發多種疾病，從輕微的胃腸、傷口感染到危及生命的敗血癥及壞死性筋膜炎[2]，對于魚類，可引發出血病、紅鰭病及敗血癥等疾病。目前，嗜水氣單胞菌所引起的疾病已成為威脅我國水產養殖業的重要傳染病，給我國水產養殖業造成了嚴重的經濟損失[3]。因此，建立一種快速、準確的診斷方法顯得尤為重要。實時熒光定量PCR是近年發展起來的一種新技術，與普通PCR相比，具有自動化程度高、快速、敏感、特異性好的特點[4]，現已被廣泛應用于生命科學研究的各個領域，例如細胞因子[5]、基因表達[6]、病毒篩選[7]和細菌病原體檢測[8]等。本研究旨在建立基于TaqMan探針的雙重實時熒光定量PCR方法，可同時完成嗜水氣單胞菌的快速檢測及毒力確認，為預防和監測致病性嗜水氣單胞菌病的流行提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品 嗜水氣單胞菌質控菌株ATCC7966、大腸桿菌DH5α及特異性檢測所用菌株均為本實驗室保存。魚類樣品采集于長春周邊養魚場及水產市場。

1.2 主要試劑與儀器 PCR擴增預混液Premix PrimeSTAR HS、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker及PMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒和質粒提取試劑盒購自OMEGA公司；熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司產品。實時定量PCR擴增儀(ABI StepOne Plus)，核酸蛋白檢測儀(Quawell Q5000)。

1.3 引物及探針的設計及合成 參考文獻[9]，針對嗜水氣單胞菌屬特異性16S rDNA基因片段，合成了引物和TaqMan探針，報告基團為FAM，淬滅基團為TAMRA。同時用Premier 5.0生物軟件針對嗜水氣單胞菌氣溶素基因設計特異性引物和探針，報告基團為VIC，淬滅基團為BHQ1。引物、探針由invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物及探針序列

Tab.1 Sequences of primers and probes

Primer/probeSequences(5′-3′)Productsize(bp)AH16SrDNA?FGGCCTTGCGCGATTGGATAT103AH16SrDNA?RGTGGCTGATCATCCTCTCAGAAH16SrDNA?PFAM?CAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGG?TAMRAAHaerA?FGCTCCAAGATCCCGGTGAAG146AHaerA?RGCGGTTGTCCGGATGGGTATAHaerA?PVIC?CGAGCTCTACAAGGCTGACATCTCCT?BHQ1

1.4 質粒標準品模板的制備 以ATCC7966基因組DNA為模板，擴增嗜水氣單胞菌16S rDNA基因特異性片段和氣溶素基因片段，凝膠回收試劑盒回收擴增的目的片段，與pMD18-T載體連接，分別轉化DH5α感受態細胞，陽性克隆提取質粒，作為熒光定量PCR模板。

1.5 雙重TaqMan實時熒光定量PCR反應條件的優化 熒光定量PCR反應體系為20 μL，反應條件為95 ℃預變性15 min，95 ℃，1s；60 ℃，20s，40個循環。設立陰性對照(去離子水)。分別以0.3 μL、0.5 μL、0.7 μL的引物及探針進行反應(各條引物、探針使用液均為10 μmol/L)，以確定最佳引物濃度及探針濃度。

1.6 標準曲線的建立 重組質粒以核酸蛋白檢測儀測定核酸濃度，根據重組質粒的堿基數計算分子質量，換算單位體積拷貝數。將質粒標準品10倍梯度稀釋(109拷貝/μL～100拷貝/μL)，分別取2 μL作為模板進行熒光定量PCR擴增，進而建立標準曲線。

1.7 特異性試驗 以不同種屬(嗜水氣單胞菌ATCC7966、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、維氏氣單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、豬霍亂弧菌，肺炎克雷伯菌、不動桿菌、鏈球菌、及嗜麥芽寡養單胞菌)細菌基因組DNA為模板，進行雙重嗜水氣單胞菌TaqMan熒光定量PCR擴增，同時設陰性對照，鑒定其特異性。

1.8 重復性試驗 以3個不同濃度的2種質粒標準品(107copies/μL、105copies/μL及103copies/μL)為模板，進行熒光定量PCR重復性試驗。

1.9 敏感性試驗 將109～100 copies/μL的質粒標準品進行雙重TaqMan熒光定量PCR，并同時進行普通PCR，比較2種方法的檢出限，確定敏感性指標。

1.10 實際樣品的檢測 73份淡水魚鰓拭子及腸道內容物樣品懸液以細菌基因組提取試劑盒抽提DNA制備模板，雙重TaqMan熒光定量PCR進行檢測，同時以普通PCR方法擴增。參考文獻[10]方法，73份樣品進行致病性嗜水氣單胞菌的分離培養及鑒定。

2 結 果

2.1 雙重TaqMan實時熒光定量PCR最佳反應體系的確定 經過對退火溫度、模板、引物和探針的濃度進行優化，確定雙重TaqMan 熒光定量PCR 20 μL反應體系的最佳組成為：Premix Ex Taq 10 μL，ROX 2 μL，引物、探針各0.5 μL，ddH2O 3 μL，模板2 μL。

2.2 標準曲線的建立 以優化的熒光定量PCR方法對梯度稀釋的質粒標準品進行擴增，建立熒光定量PCR標準曲線(圖1)，16S rDNA基因及Aero基因擴增方程式分別為y=-3.393x+38.879和y=-3.19x+38.567，相關系數R2達到0.998及1。

圖1 熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard curves of fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性檢測 沙門氏菌、腸球菌和大腸桿菌等其他種屬細菌的擴增結果均為陰性，僅嗜水氣單胞菌呈現良好的擴增曲線，證明了該雙重熒光定量PCR方法的特異性。

2.4 重復性試驗 3個梯度的質粒標準品重復擴增4次，雙重熒光定量PCR擴增曲線重疊性好，Ct值誤差不到1個循環，變異系數(CV)在0.18%～0.55%之間，具有較高的可重復性，保證了檢測結果的可靠性和穩定性(表2)。

表2 熒光定量PCR重復性試驗結果

Tab.2 Results of reproducibility test

Copies/μLTargetGenesCTValues1234xsCV(%)10716s12．4112．2612．2712．3312．320．060．49A12．8012．7212．8712．9112．830．070．5510516s19．8919．8120．0219．7619．870．100．50A20．5520．5020．3820．3720．450．080．3910316s27．7227．7028．0027．9127．830．130．47A28．3528．3728．2628．2728．310．050．18

2.5 敏感性試驗 結果表明雙重熒光定量PCR對2種目的基因的最低檢測限均為10拷貝(圖2)，而常規PCR的最低檢測限為103拷貝(圖3)。

2.6 實際樣品檢測結果 熒光定量PCR檢測嗜水氣單胞菌陽性率為97.26%(71/73)，氣溶素基因陽性率為79.45%(58/73)；普通PCR檢測嗜水氣單胞菌陽性率為72.60%(53/73)，氣溶素基因陽性率為20.55%(15/73)。其中熒光定量PCR檢測陰性樣品普通PCR方法檢測也為陰性，普通PCR檢測陽性樣品熒光定量PCR檢測同樣為陽性。以致病性嗜水氣單胞菌選擇性培養基進行分離培養并進行生化鑒定，73份樣品有15份分離到致病性嗜水氣單胞菌，均為熒光定量PCR檢測陽性樣品，陰性樣品未分離到致病性嗜水氣單胞菌。

1: 109copies；2：108copies；3：107copies，以此類推1: 109copies；2: 108copies；3: 107copies, and so on.圖2 雙重熒光定量PCR的敏感性檢測Fig.2 Sensitivity analysis of fluorescence quantitative PCR

1～10孔的模板濃度依次為109～100 copies；M：100bp Marker；N：陰性對照1-10: 109-100 copies; M: 100bp Marker; N: Negative control.圖3 雙重常規PCR的敏感性檢測Fig.3 Sensitivity analysis of ordinary PCR

3 討 論

水產品的安全問題越來越受到全社會的關注，嗜水氣單胞菌作為水產品中的常見菌，在水生環境中廣泛分布，根據其毒力差異，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物，輕可引起皮膚感染及腹瀉，重者引起敗血癥，是一種典型的人獸共患病病原菌。目前，由于致病性嗜水氣單胞菌引起水產養殖疾病的頻發及人感染病例日漸增多，該菌的檢測及防治變得愈加重要。

熒光定量PCR技術兼備核酸高效擴增和精確定量等優點，且假陽性率低、重復性好，與普通PCR相比具有明顯的優勢。本研究使用Premix Ex TaqTM預混酶替代了前期實驗中的Ex Taq Hot Star、10×buffer和dNTP等試劑，使繁瑣的加樣過程變得簡單、快速，并且降低了操作過程中污染的機率。建立的的熒光定量PCR方法對沙門氏菌、腸球菌、大腸桿菌等12種其他屬的菌株進行檢測，結果均為陰性，證明該方法對致病性嗜水氣單胞菌具有很好的特異性，且敏感性高，最低檢測限達到普通PCR方法的100倍。

該方法能夠對實際樣品的核酸提取物進行直接檢測，使得檢測結果更加快速、準確，同時能判定樣品中目的菌的數量。在樣品中目的菌較少的情況下，常規的分離培養難以獲得陽性結果。實際樣品的檢測及分離鑒定結果表明，所有分離株均來源于熒光定量PCR陽性樣品，且aerA基因拷貝數高的樣品目的菌的分離率較高，進一步驗證了本方法的實用性。本研究建立的雙重熒光定量PCR檢測方法可用于致病性嗜水氣單胞菌感染的診斷、疾病防控及流行病學研究。

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Establishment and application of a duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection ofAeromonashydrophila

GAO Zhi-ling1,2, JI Xue1, GUO Xue-jun1, CHEN Ping2, LIU Yan-jing3, LIU Jun1,ZHU Ling-wei1, ZHOU Wei1, FENG Shu-zhang1, SUN Yang1

(1.InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS,theKeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;3.TheAffiliatedHospital,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130021,China)

To establish a method of duplex real-time fluorescence quantitative PCR assay for detectingAeromonashydrophilaand pathogenicA.hydrophilasimultaneously, two sets of primers and TaqMan probes were designed based on the sequences of the 16S rDNA and aerolysin (aerA) gene. Then the method was constructed and optimized. The specificity, sensitivity and reproducibility of the method were tested, and the clinic samples were detected. Results showed the sensitivity of the duplex real-time TaqMan PCR assay for testing of recombinant plasmids was 10 copies per reaction, which was 100 times higher than ordinary PCR method. No specific amplification was presented when twelve species of other bacteria genera were tested. The detection results of clinic samples showed that the sensitivity was also higher than that of ordinary PCR. And the gene copy numbers of quantitative detection were proportional to the rate separation. The method was highly sensitive, specific and practical, and could be used for the diagnosis, disease prevention and control and epidemiologic study of pathogenicA.hydrophila.

Aeromonashydrophila; fluorescent quantitative PCR; detection; application

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.016

國家科技部傳染病重大專項(No.2013ZX10004-217-002)和吉林省科技計劃項目(No.20140101032JC，20150101110JC)聯合資助

孫 洋，Email: sunyang10@hotmail.com

1. 軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130122； 2. 吉林農業大學，食品科學與工程學院，長春 130118； 3. 長春中醫藥大學附屬醫院，長春 130021

S852.61；R378

B

1002-2694(2016)12-1126-05

2016-05-01；

2016-07-22