高脂血清對人主動脈血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制

劉晴，湯潛，王莎莎，韓彥弢，王春波

(1青島大學醫學部藥學院藥理學系，山東青島266000；2青島大學附屬醫院中心實驗室;3青島大學藥學院)

高脂血清對人主動脈血管平滑肌細胞增殖的影響及其機制

劉晴1，湯潛2，王莎莎2，韓彥弢3，王春波3

(1青島大學醫學部藥學院藥理學系，山東青島266000；2青島大學附屬醫院中心實驗室;3青島大學藥學院)

目的 觀察高脂血清對人主動脈血管平滑肌細胞(HASMC)增殖的影響，并探討其機制。方法 取對數生長期HASMC細胞分為實驗組和和對照組，實驗組包括實驗1、2、3組，另設空白對照組。對照組常規培養；實驗1、2、3組分別加入10%、15%、20%濃度的高脂血清培養；空白對照組僅加培養基無細胞。繼續培養6、12、24、48 h，用CCK-8法測算實驗組HASMC細胞增殖率；培養24 h時采用實時熒光定量PCR法檢測各組HASMC中GRIM-19和p-STAT3 mRNA，采用Western blotting法檢測GRIM-19和p-STAT3蛋白。結果 相同時間點細胞增殖率實驗3組高于實驗2組，實驗2組高于實驗1組，P均<0.05。隨著高脂血清培養時間增加，各組HASMC細胞增殖率呈遞增趨勢，P均<0.05。培養24 h時HASMC中GRIM-19 mRNA和蛋白實驗3組低于實驗2組，實驗2組低于實驗1組，P均<0.05；HASMC中p-STAT3 mRNA和蛋白實驗3組高于實驗2組，實驗2組高于實驗1組，P均<0.05。結論 高脂血清可以促進HASMC增殖。與10%、15%的高脂血清相比，20%高脂血清促進HASMC增殖的效果最為明顯。其作用機制可能與GRIM-19下調p-STAT3表達有關。

人主動脈血管平滑肌細胞；細胞增殖；維甲酸干擾素誘導凋亡相關基因; 轉錄信號轉導子與激活子3

動脈粥樣硬化(AS)的發病機制目前尚不明確，已有的研究證實AS與心血管平滑肌細胞的增殖有密切關系[1，2]。國內有學者通過實驗研究證明高脂血清能夠引起大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞的增殖[3]，這與高膽固醇飲食會增加AS發病率相符。但是目前有關研究大都局限在大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞，高脂血清對人主動脈血管平滑肌細胞(HASMC)增殖的影響及其機制尚不明確。維甲酸干擾素誘導凋亡相關基因家族(GRIMs)是新近發現的一種參與干擾素(IFN)和維甲酸(RA)誘導的細胞凋亡的基因，是一種抑癌基因[4]。GRIM-19是GRIMs成員。目前已證明GRIM-19基因參與腫瘤細胞的增殖和凋亡過程，但其在心血管系統發揮的作用尚不明確。轉錄信號轉導子與激活子3(p-STAT3)是STAT家族的重要成員之一，參與細胞的增殖、分化及凋亡調控，其通路的持續激活可以導致細胞異常增殖和惡性轉化，但p-STAT3是否參與了高脂血清誘導的HASMC增殖和凋亡過程尚無報道。本研究觀察了高脂血清對人HASMC增殖的影響，并探討GRIM-19、STAT3在其中發揮的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 HASMC細胞購買于廣州吉尼歐生物公司； CCK-8試劑盒購于廣州奕源生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、高膽固醇血清(高脂血清)、0.25%胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；TRIzol購于美國Invitrogen公司；逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購于TaKaRa公司；RT-PCR所需引物由上海生工生物工程公司合成；GRIM-19小鼠單克隆抗體、p-STAT3兔單克隆抗體購于Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠抗二抗均購于北京中杉金橋公司；細胞裂解液購于碧云天生物技術公司，ECL化學發光試劑盒購于Pierce公司；聚二氟乙烯(PVDF)膜購于美國Milli-pore公司。

1.2 HASMC分組和培養方法 用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱內培養HASMC細胞。待細胞貼壁后用0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期HASMC細胞，接種于細胞培養瓶。設實驗組和和對照組，實驗組包括實驗1、2、3組，另設空白對照組。對照組常規培養；實驗1、2、3組分別加入10%、15%、20%濃度的高脂血清培養；空白對照組僅加培養基無細胞。

1.3 實驗組細胞增殖率測算 采用CCK-8法。繼續培養6、12、24、48 h收集各組細胞接種于96孔板中，每孔100 μL，HASMC數5 000個。向每孔加入10 μL CCK-8溶液，用酶標儀在450 nm處測定吸光度。實驗組細胞增殖率(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各實驗組HASMC中GRIM-19、p-STAT3表達檢測 ①GRIM-19、p-STAT3 mRNA: 采用RT-PCR方法。 培養24 h時取各組HASMC消化后，加入TRIzol 1 mL，一步法抽提總RNA，實驗步驟嚴格按照試劑說明書進行。紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，取2 μL總RNA進行逆轉錄，GRIM-19上游引物為3′-CGTCAAAGGTGAAGCAGGAC-5′,下游引物為3′-CTCCAGTGCCCGTAGATCAG-5′，STAT3上游引物為3′-GAGCTGGCTGACTGGAAGAG-5′，下游引物為3′-TGTTGACGGGTCTGAAGTTG-5′，所有引物由上海生工公司合成。以GAPDH為內參照，用2-ΔΔCt表示GRIM-19、p-STAT3 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。② GRIM-19、p-STAT3蛋白：培養24 h時采用Western blotting法檢測各組細胞GRIM-19、p-STAT3蛋白，操作按試劑盒說明書進行。GAPDH為內參照。用Image J軟件測算各條帶灰度值。GRIM-19、p-STAT3蛋白相對表達量以目的條帶和GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結果

2.1 各實驗組HASMC胞增殖率比較 不同時間點各組HASMC細胞增殖率見表1。同一時間點細胞增殖率實驗3組高于實驗2組，實驗2組高于實驗1組，P均<0.05。隨著高脂血清培養時間增加，各組HASMC細胞增殖率呈遞增趨勢，P均<0.05。

表1 不同時間點各實驗組細胞增殖率比較±s)

注：與實驗1組相比，*P<0.01；與實驗2組相比，#P<0.01。

2.2 各實驗組HASMC中GRIM-19、p-STAT3 比較 培養24 h各組HASMC中GRIM-19、p-STAT3 mRNA和蛋白表達量見表2。HASMC中GRIM-19 mRNA和蛋白實驗3組低于實驗2組，實驗2組低于實驗1組，P均<0.05；HASMC中p-STAT3 mRNA和蛋白實驗3組高于實驗2組，實驗2組高于實驗1組，P均<0.05。

表2 培養24 h各實驗組HASMC中GRIM-19、p-STAT3mRNA和蛋白表達量比較

注：與實驗1組相比，*P<0.01；與實驗2組相比，#P<0.01。

3 討論

AS是動脈壁變厚并失去彈性的幾種疾病的統稱，與血脂異常及血管壁成分改變有密切關聯。動脈內膜下脂質沉積、平滑肌細胞和纖維基質成分的增殖都是該病的主要表現。當前AS的發生機制研究是國內外研究的熱點。血管平滑肌細胞的增殖是AS發生的重要環節[5]。腫瘤細胞增殖與血管平滑肌細胞增殖可能有相同的機制，故原癌基因與抑癌基因可能在AS的發生過程中起到重要作用。

血清是細胞培養中不可或缺的組成成分，其中包含多肽類生長因子、激素和脂類等，對于細胞的增殖和分化具有重要的作用。有研究[6]發現，高脂血清能夠使細胞表型發生改變，可以促進體外培養的大鼠血管平滑肌細胞增殖。本研究結果顯示，用10%、15%、20%的高脂血清培養HASMC，HASMC細胞增殖率隨高脂血清濃度和培養時間的增加而升高；培養24 h時HASMC中GRIM-19表達隨高脂血清濃度濃度增加而下降，p-STAT3表達達隨高脂血清濃度濃度增加而升高。表明高脂血清培養可以促進HASMC增殖。與10%、15%的高脂血清相比，20%高脂血清促進HASMC增殖的效果最為明顯。其機制可能與高脂血清下調GRIM-19表達，上調p-STAT3表達有關。

GRIMs是一組可被IFN-β聯合RA誘導并促進細胞凋亡的基因。GRIM-19是抑癌基因，在多種正常組織中表達，參與腫瘤細胞凋亡過程[7～9]。GRIM-19基因受干擾素等刺激后表達量增加，并迅速轉移進入細胞核，在細胞核中有微量表達。人類多種正常組織中均有GRIM-19基因的表達，且其分布具有顯著的組織特異性，心臟和骨骼肌中的表達較高[10]。p-STAT3是STAT家族的重要成員之一，參與細胞的增殖、分化和凋亡調控過程[11]。研究表明，GRIM-19參與調控STAT家族中的STAT3活性，而與其他STAT家族成員的活性無關[12]。GRIM-19被認為是STAT3表達和激活的負性調節子，Zhang等[13]采用酵母雙雜交文庫篩選法首次證實了GRIM-19可特異性結合STAT3，GRIM-19與STAT3相互作用并調節cyclinD1、cyclinB1、c-myc、Bcl-2、Bcl-XL等下游靶基因的活性，從而促進凋亡。GRIM-19抑制STAT3的功能可以有效的干預腫瘤的生長，這為以STAT3作為靶點的腫瘤基因治療提供了新的突破口[14]。因此，對腫瘤中GRIM-19基因表達及其與靶基因STAT3之間調節機制的研究，不僅對腫瘤的發病機制提供新的理論基礎，同時也為AS臨床治療提供新的理論依據，具有潛在的臨床價值[15]。

本研究發現高脂血清對HASMC細胞的增殖有促進作用，在這個過程中GRIM-19和p-STAT3基因的表達都發生了變化，即在HASMC中也存在著GRIM-19的低表達，同時伴隨p-STAT3的高表達，這與該基因在腫瘤中的研究趨勢相同。高脂血清對HASMC的作用機制可能是其通過下調GRIM-19，使p-STAT3表達上調，從而上調節其下游靶基因cyclinD1、Bcl-2的表達，而促進細胞增殖[16,17]。而高脂血清是如何促進GRIM-19基因的表達下調，需要在以后的研究中進一步解釋。

綜上所述，高脂血清能夠促進人HASMC增殖，且高脂血清濃度越高，效果越明顯。其機制可能與GRIM-19基因和STAT3通道有關。這將為治療AS開啟新的靶點治療方向。

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王春波(E-mail: cbwang666@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.018

R966

B

1002-266X(2016)47-0061-03

2016-08-10)