毛細血管瘤患兒增生期和退化期瘤組織中AMPK、mTOR表達對比觀察

李娟，俞松，王凱，柳望舒，季一發，甘永橋

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

毛細血管瘤患兒增生期和退化期瘤組織中AMPK、mTOR表達對比觀察

李娟，俞松，王凱，柳望舒，季一發，甘永橋

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

目的 對比觀察增生期和退化期小兒毛細血管瘤組織中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達，探討AMPK/mTOR通路在小兒毛細血管瘤消退過程中的作用。方法 收集50例小兒毛細血管瘤患者的瘤組織標本，按照Mulliken分類法24例患兒瘤組織處于增生期(增生期組)，26例患兒瘤組織處于退化期(退化期組)，采用免疫組織化學法檢測其中AMPK、mTOR的積分光密度。結果 增生期組AMPK、mTOR的積分光密度分別為33.94±12.78、182.43±47.10，退化期組分別為85.87±19.53、47.22±44.52。兩組毛細血管瘤組織AMPK、mTOR積分光密度相比，P均<0.01。50例小兒毛細血管瘤患者瘤組織AMPK、mTOR積分光密度值呈負相關(r=-0.78，P<0.01)。結論 與增生期小兒毛細血管瘤組織相比，消退期小兒血管瘤組織中AMPK表達升高，mTOR表達降低。AMPK/mTOR信號通路參與小兒毛細血管瘤的消退過程。

血管瘤；毛細血管瘤；兒童；5磷酸腺苷活化蛋白激酶；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；血管瘤分期

毛細血管瘤是血管內皮細胞及周細胞的異常增殖導致的良性血管腫瘤，為兒童最常見的良性腫瘤[1]，歷經增生期、消退期及消退完全期3個自然進程。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在小兒血管瘤消退過程中起到重要作用[1]，PI3K/Akt非依賴性途徑磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號通路與多種腫瘤發生發展有關[2～4]，但其與小兒毛細血管瘤消退的關系尚不明確。本研究檢測并比較了增生期和消退期小兒毛細血管瘤組織中AMPK、mTOR的表達，探討AMPK/mTOR信號通路在小兒毛細血管瘤消退中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2008～2015年間存檔的50例小兒毛細血管瘤患者的瘤組織蠟塊。患兒中男20例、女30例，年齡4個月～13歲，平均28.3個月。毛細血管瘤分布在頸部35例、背部22例、上臂28例及腹部皮膚11例。患兒術前均未做任何輔助性治療，因瘤體巨大或增長迅速等原因，家屬強烈要求手術切除。標本使用征得家長同意。根據Mulliken分類分為增生期24例(增生期組)和消退期26例(消退期組)。

1.2 毛細血管瘤組織AMPK、mTOR檢測方法 采用免疫組化SP法。一抗分別為濃縮型兔抗人/鼠/兔AMPK-a單克隆抗體、濃縮型兔抗人/鼠/兔mTOR單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology Inc生產)。一抗工作濃度1∶50。操作按試劑盒說明書進行。以已知陽性切片作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。AMPK以細胞核出現棕黃色或棕黑色顆粒為陽性細胞，mTOR以胞膜出現棕黃色或棕黑色顆粒為陽性細胞。用LICA DM1000研究顯微鏡觀察切片，用LICA DFC 280攝像頭進行圖像采集，每張切片隨機選取10個視野，保證在同等條件下拍照存檔。用IPWIN60圖像分析軟件進行圖像分析計算AMPK、mTOR積分光密度(IOD)值，取平均值。

2 結果

增生期組AMPK、mTOR的IOD分別為33.94±12.78、182.43±47.10，退化期組分別為85.87±19.53、47.22±44.52。消退期組毛細血管瘤組織AMPK的IOD低于增生期，mTOR的IOD高于消退期(P均<0.01)。50例小兒毛細血管瘤患者瘤組織AMPK、mTOR的IOD呈負相關(r=-0.78，P<0.01)。

3 討論

毛細血管瘤是血管內皮細胞及周細胞的異常增殖導致的良性血管腫瘤，為兒童最常見的良性腫瘤[5]，歷經增殖期、消退期及消退完全期3個自然進程。小兒毛細血管瘤消退與否，主要取決于調控血管內皮細胞增殖或凋亡信號傳導通路的變化情況。mTOR為多條信號通路的交匯點，是調節細胞生長和增殖的關鍵分子。基因改變或信號通路傳遞異常，可激活mTOR，活化的mTOR磷酸化下游核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶(p70S6K)及真核起始因子4E(eIF-4E)結合蛋白1(4E-BP1)促進蛋白質翻譯，使細胞周期從G1期直接進入S期并大量增殖，毛細血管瘤進入增生期。而當mTOR/p70S6K信號通路受到抑制時，mTOR活化受阻，抑制p70S6K及4E-BP1磷酸化，從而抑制蛋白質翻譯，導致細胞周期阻滯并誘導細胞凋亡，毛細血管瘤進入消退期[6,7]。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由α催化亞基，β、γ調節亞基組成的異源三聚體[8]。AMPK在真核生物中具有高保真性，能夠保守地調節細胞低能量狀態，被認為是“細胞能量調節器”。AMPK通過感知外環境變化，如細胞間壓力改變、營養奪獲、缺氧或受二甲雙胍調節使得一磷酸腺苷濃度增加，而被激活[9]。PI3K/Akt非依賴性途徑AMPK/mTOR信號通路通過感知AMP/ATP比值實現對mTOR的負性調控[10]。當腫瘤細胞迅速增殖，細胞間壓力改變且依賴有氧糖酵解途徑消耗大量能量，AMP/ATP比值增加，AMPK/mTOR信號通路被激活[11]。與PI3K/Akt/mTOR信號通路的作用相反，活化的AMPK可通過直接激活TSC1/2復合體，下調mTORC1復合體活性。而缺乏TSC2的細胞可通過AMPK磷酸化Raptor亞基上的兩個保守的蘇氨酸位點誘導14-3-3結合，使Raptor脫離mTORC1復合體，下調mTORC1活性[12～15]。

研究表明，抑制mTOR表達或減低mTOR的活性可使下游的4EBP1、p70S6K、RSK及eIF4G1磷酸化受阻，蛋白質合成受到抑制，最終導致細胞周期阻滯并觸發凋亡，血管瘤消退[6,7]。尉娜等[16]發現激活狀態的AMPK/mTOR信號通路，可抑制血管內皮細胞增殖及代謝，并促進血管內皮細胞凋亡。本研究結果顯示，增生期毛細血管瘤組織AMPK表達低于消退期，mTOR高于消退期，提示在毛細血管瘤增生期，血管內皮細胞大量增殖和能量代增強使組織處于缺氧狀態，AMPK系統被激活，導致活化AMPK在細胞中呈高表達，進而抑制mTOR表達，并使其下游分子磷酸化過程受阻，進而抑制蛋白質合成，將細胞周期阻滯在G0/G1期，抑制血管內皮細胞的增殖、代謝，誘導細胞凋亡，進而使毛細血管瘤消退。

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