血清載脂蛋白B橢偏光蛋白質(zhì)芯片技術(shù)定量檢測的條件優(yōu)化

寧翔，王嬌嬌，王娟，畢少杰，盛林

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南250033；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

血清載脂蛋白B橢偏光蛋白質(zhì)芯片技術(shù)定量檢測的條件優(yōu)化

寧翔1，王嬌嬌2，王娟1，畢少杰1，盛林1

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南250033；2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

目的 優(yōu)化橢偏光蛋白芯片技術(shù)定量檢測血清載脂蛋白B(ApoB)的條件，并觀察最佳條件下橢偏光蛋白芯片技術(shù)定量檢測血清ApoB的準確性。方法 用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測含有0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的載脂蛋白B抗體(anti ApoB)和200 μg/mL ApoB標準品的溶液，測得灰度值最高者選為最佳anti-ApoB濃度。用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB標準品溶液，anti- ApoB濃度為0.3 mg/mL，結(jié)果以灰度值表示。然后在上述標準品溶液中加入蛋白G使其終濃度為0.1 mg/mL，再檢測一次灰度值。比較兩次檢測的灰度值，確定是否應(yīng)該加入0.1 mg/mL蛋白G。最佳條件下橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測0、5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB標準品溶液，計算上述ApoB標準品溶液灰度值與不含ApoB的空白探針溶液(含anti ApoB和蛋白G)灰度值的差值。對上述ApoB標準品溶液濃度和灰度值差值的相關(guān)性進行分析，以ApoB標準品溶液濃度為橫坐標，灰度值差值為縱坐標描畫標準曲線并建立方程。最佳條件下用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測16份40倍稀釋的已知ApoB濃度(采用免疫比濁法測定)血清的灰度值兩次。用上述方程計算16份血清中ApoB濃度，并與其實際ApoB濃度比較。結(jié)果 最佳anti-ApoB濃度為0.3 mg/mL。與不應(yīng)用蛋白G者相比，應(yīng)用0.1 mg/mL蛋白G的橢偏光蛋白芯片技術(shù)測得樣品的灰度值高(P均<0.05)。以ApoB濃度為橫坐標x、灰度差值為縱坐標y描畫標準曲線，Maple9.5軟件得出的回歸方程為：y=-23.116Ln(1-x/60)，R2=0.936 4。16份血清ApoB濃度和第一次、第二次用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測測得血清ApoB濃度相比P均>0.05。結(jié)論 橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB的最佳條件為anti-ApoB濃度0.3 mg/mL，蛋白G濃度0.1 mg/mL。此條件下橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB結(jié)果準確。

橢偏光蛋白芯片技術(shù)；光學(xué)蛋白質(zhì)芯片；橢偏光生物顯微成像技術(shù)；載脂蛋白B；載脂蛋白B抗體；蛋白G

載脂蛋白B(ApoB)是致動脈硬化脂蛋白，即極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和中密度脂蛋白(IDL)的主要成分。血清ApoB在預(yù)估心腦血管疾病風(fēng)險和診斷高脂蛋白血癥、異常脂蛋白血癥(如高ApoB血癥等)方面有重要臨床意義。但是由于ApoB的檢測方法沒有標準化，其臨床應(yīng)用不多。橢偏光蛋白芯片技術(shù)是光學(xué)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和橢偏光學(xué)生物顯微顯像技術(shù)的結(jié)合的一項新技術(shù)，已被用于檢測可溶性 Tie-2 、腫瘤標志物CA15-3等，但尚未見用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB的研究，其中配基載脂蛋白B抗體(anti-ApoB)和蛋白G的最佳濃度及其檢測效果更不明確。本研究對橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB的條件進行了優(yōu)化，并在最佳條件下用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測已知ApoB濃度血清中的ApoB，觀察檢測結(jié)果準確性。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 橢偏光學(xué)生物顯微成像系統(tǒng)、光學(xué)蛋白質(zhì)芯片分析系統(tǒng)及軟件(EIES2003軟件包)、微流道生物反應(yīng)器系統(tǒng)(微陣列塊、微流道塊、蓋板和多通道蠕動泵)、超凈工作臺均由中國科學(xué)院力學(xué)研究所微重力實驗室制造并提供。單晶拋光硅片購自洛陽單晶硅片廠；單克隆山羊抗人載脂蛋白B抗體(anti-ApoB)和人載脂蛋白B(ApoB)標準品均購自USBiological公司；蛋白G和人血清白蛋白(HSA)均購自Sigma公司。上述蛋白均用1%的PBST液溶解和稀釋。表面活性劑(NE)配比為0.05 mol/L 1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基一碳二亞胺鹽酸鹽和0.2 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺混合溶液。16例健康查體者的血清由山東省內(nèi)分泌代謝病研究所檢驗科提供，其中ApoB的濃度為免疫比濁法檢測所得。

1.2 橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測ApoB時anti-ApoB和蛋白G濃度的優(yōu)化

1.2.1 anti-ApoB濃度的優(yōu)化 首先進行芯片表面羧基化改性：將切好的拋光硅片用去離子水洗凈，加入體積比為1∶3的過氧化氫和濃硫酸混合液，置于搖床輕微振蕩30 min。無水乙醇洗凈，并加入體積比為1∶15的3-氨基丙基三乙氧基硅烷無水乙醇混和液，置于搖床輕微振蕩2 h。無水乙醇洗凈，加入琥珀酸酐乙醇飽和溶液，置于搖床輕微振蕩過夜。無水乙醇洗凈，并封存待用。每個芯片微通道均加入10 μL表面活化劑(NE)，以4 μL/min的流速與芯片反應(yīng)。配制5份200 μg/mL的ApoB標準品溶液，每份20 μL，在其中加入anti-ApoB使其終濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL。將上述溶液以2 μL/min的流速與芯片反應(yīng)10 min。用10 mg/mL HSA溶液30 μL以1 μL/min的流速封閉30 min，用PBST與去離子水50 mL再清洗一次。反應(yīng)結(jié)束后去離子水沖洗芯片表面，氮氣吹干，放置在光學(xué)橢偏顯微成像系統(tǒng)檢測平臺上，EIES2003軟件包觀測和讀取灰度值。比較各組灰度值，灰度值最高者對應(yīng)的anti-ApoB濃度為最佳anti-ApoB濃度。

1.2.2 蛋白G濃度的優(yōu)化 用上述方法檢測5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB標準品溶液的灰度值，anti-ApoB濃度為0.3 mg/mL。然后在上述標準品溶液中加入蛋白G使其終濃度為0.1 mg/mL，再檢測一次灰度值。比較兩次檢測的灰度值。

1.3 最佳條件下橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB結(jié)果準確性觀察 最佳條件下用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測0、5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB標準品溶液的灰度值，計算上述ApoB標準品溶液灰度值與不含 ApoB的空白探針溶液(含anti-ApoB和蛋白G)灰度值的差值。對上述ApoB標準品溶液濃度和灰度值差值的相關(guān)性進行分析，以ApoB標準品溶液濃度為橫坐標，灰度值差值為縱坐標描畫標準曲線并用Maple9.5軟件建立方程。最佳條件下用橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測16份40倍稀釋的已知ApoB濃度血清的灰度值。將灰度值代入上述方程計算16份血清ApoB濃度，并與其實際ApoB濃度進行比較。本實驗共進行2次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件。相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測ApoB的最優(yōu)條件 用0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的anti-ApoB和橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測200 μg/mL的ApoB標準品溶液，所得灰度值分別為67.02、73.81、66.38、66.92、68.44，anti-ApoB濃度為0.3 mg/mL時所得灰度值最大，定為最佳anti-ApoB濃度。

用0.3 mg/mL的anti-ApoB和橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測5、10、20、50、100、200 μg/mL ApoB標準品溶液，所得灰度值分別為70.69、88.24、87.69、89.22、91.44、94.23。加入0.1 mg/mL的蛋白G后重新測量，所得灰度值分別為106.49、108.12、120.25、133.64、140.77、141.03，均比未加蛋白G時高。蛋白G最佳濃度為0.1 mg/mL。

2.2 最佳條件下橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測血清ApoB結(jié)果準確性 以ApoB濃度為橫坐標x、灰度差值為縱坐標y描畫標準曲線，Maple9.5軟件得出的回歸方程為：y=-23.116Ln(1-x/60)，R2=0.936 4。16份血清ApoB濃度和橢偏光蛋白芯片技術(shù)測算所得血清ApoB濃度見表1。16份血清apoB濃度和第一次、第二次用橢偏光蛋白芯片技術(shù)測算所得血清apoB濃度相比P均>0.05。

表1 16份血清apoB濃度和橢偏光蛋白芯片技術(shù)檢測所得血清apoB濃度比較(mg/mL)

3 討論

橢偏光蛋白芯片技術(shù)的檢測原理是基于生物分子之間(如抗原與抗體、受體與配體、酶與底物等)的高度特異性結(jié)合能力。橢偏光成像系統(tǒng)可以檢測到0.1 nm厚的分子膜層，因此能夠很敏感的檢測到反應(yīng)前后分子膜層厚度變化，從而證實待測液中抗原的存在并計算其濃度。橢偏光蛋白芯片生物學(xué)檢測技術(shù)的優(yōu)點主要有：①可以同時檢測多元樣品，既可以同時檢測一個樣品中的多種蛋白，也可以同時檢測含有同一種蛋白的多個樣品；②樣品無需任何標記和純化處理，不影響檢測物的生物學(xué)活性；③樣品用量少，采用可以達到次單分子膜層分辨能力的光學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，樣品用量僅在10 μL量級；④可以實時檢測生物分子的相互作用過程，獲得反應(yīng)速率及反應(yīng)條件等生物分子反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)；⑤檢測速度快并且結(jié)果直觀，檢測結(jié)果均以數(shù)字圖像形式輸出，可以進行定性和定量檢測[1～3]。

芯片表面微格式化是對原本物理化學(xué)性質(zhì)均一的表面進行一定操作，使其帶有所需要的格式的過程。蛋白質(zhì)芯片的表面，經(jīng)過表面微格式化處理，蛋白質(zhì)探針就會分布在特定區(qū)域。微流道法是光學(xué)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)常用的表面微格式化方法[4，5]。通過微流道系統(tǒng)，各種蛋白質(zhì)分子被分別的運送到芯片上的各個單元，并且同時完成固定的過程。如果對芯片上各個探針有著復(fù)雜的要求，只需在微流道的點樣裝置上有順序添加串并聯(lián)模塊即可。微流道系統(tǒng)不僅能夠使各個蛋白質(zhì)探針之間完全一致還能保證蛋白質(zhì)探針內(nèi)部也同樣均勻。除此之外，微流道系統(tǒng)大大縮短了芯片的制造時間(以本研究中固定ApoB抗體為例，用微流道方法，固定時間在10 min左右)，減少了樣品的用量(本研究中每一樣品用量在10 μL以下)；同時由于微流道是可重復(fù)使用的，成本也就得到了有效控制。

由于共價鍵的鍵能在一般情況下遠遠超過疏水作用力，其固定效果也必定要超過物理吸附。其中一種可以采用APTES進行改性和再用戊二醛進行醛基化的方法處理的硅片，疏水作用得到了有效的控制，用其固定的蛋白質(zhì)不僅數(shù)量較多，而且活性有顯著的提升[6]。本研究采用APTEs改性和再用琥珀酸酐進行羧基化的方法，效果滿意。共價固定解決了物理吸附中的蛋白質(zhì)分子易于被更有活性的蛋白或緩沖液替代而脫吸附的問題，但并不能使蛋白質(zhì)分子的活性位點定向暴露于硅片外表面，固定到硅片表面蛋白質(zhì)分子的活性還有進一步提高的可能。用蛋白A對經(jīng)過疏水化處理的硅片進行表面改性，由于蛋白A能夠同多種哺乳動物抗體分子的Fc片段特異性結(jié)合，因此，用這種方法進行改性的硅片上的抗體分子，其Fab片段都指向表面外側(cè)，也就是說，其活性部位暴露于表面外側(cè)。這樣，在固定數(shù)量幾乎保持不變的情況下，蛋白質(zhì)分子的生物學(xué)活性有了大幅度的提升，固定的效率有了大幅度的提升[7，8]。由于蛋白A的定向固定作用具有物種選擇性，蛋白G的作用更廣譜[9]。因此，本研究選擇能夠結(jié)合山羊抗人ApoB抗體的蛋白G作為定向固定蛋白。結(jié)果證實同樣的實驗條件下，裝配有蛋白G者測得灰度值要高。

在檢測對象確定以后，芯片設(shè)計中的一個重要環(huán)節(jié)就是確立特異性生物學(xué)系統(tǒng)，即能夠發(fā)生特異性結(jié)合的分子對或分子組合，如配體與受體、蛋白與蛋白、抗原與抗體、病毒與受體等，并優(yōu)選配基，以此為基礎(chǔ)實現(xiàn)配基和待測生物分子在芯片表面上的特異性復(fù)合。按照設(shè)計，在芯片上的相應(yīng)位置進行配基的安裝，并保持其原有的生物學(xué)活性，形成具有生物學(xué)活性的感應(yīng)表面。

配基的使用，實際上是配基分子上活性位點的利用。蛋白質(zhì)芯片是由多個表面生物探針組合而成，配基固定于表面上。由于生物分子與芯片基底表面的相互作用，通常會造成生物分子在表面的變形和變性，使生物活性減弱甚至消失。為了充分保持配基在芯片表面上的生物活性，需要設(shè)計芯片表面的蛋白質(zhì)活性裝配。一個典型的光學(xué)蛋白質(zhì)芯片是一個組合多種生物活性探針的微小表面，表面積可以從平方毫米到平方厘米量級，視需要而定。無論是配基的裝配還是樣品的檢測，都要在一個生物反應(yīng)器中進行。分子表面相互作用、分子間相互作用、多面元獨立處理和樣品檢測的串并行、反應(yīng)條件、結(jié)合速率、試劑用量、清洗、均一性等問題將在微小的芯片反應(yīng)器中得到體現(xiàn)。配基的濃度問題，由于反應(yīng)單元的表面積是一定的，因此所能結(jié)合配基分子的多少就有一定的濃度限制。配基濃度過小，就會造成檢測時不飽和反應(yīng)，而濃度過多就會造成樣品的浪費。本研究結(jié)果顯示檢測同一濃度的ApoB，在配基anti-ApoB濃度0.3 mg/mL時灰度值不再增加，也就是說達到飽和吸附，以此確定了最佳anti-ApoB濃度。

正常人血清ApoB濃度基本呈正態(tài)分布，濃度范圍為600～1 200 mg/L[10]。因此，本研究中結(jié)合臨床檢測范圍并考慮樣品用量節(jié)省問題，確定檢測范圍為10倍稀釋后的標準參考范圍，即5～200 μg/mL，檢測的靈敏度可達到5 μg/mL。本研究結(jié)果表明，標準品ApoB的濃度與測得灰度值和探針灰度值的差值之間具有一定的對應(yīng)關(guān)系，并以ApoB濃度為橫坐標x、灰度差值為縱坐標y繪制出標準曲線，確定方程。在對16例健康查體者的血清ApoB進行檢測時，根據(jù)測得灰度值差值和方程計算出血清ApoB濃度，結(jié)果與免疫比濁法所測的濃度值相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明檢測結(jié)果準確。以上的實驗結(jié)果提示我們，橢偏光蛋白芯片系統(tǒng)在檢測人血清ApoB蛋白方面具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

[1] Wang ZH, Jin G. A label-free multisensing immunosenso based on Imaging Ellipsometry[J]. Anal Chem, 2003,75(22):6119-6123.

[2] Jin G, Zhao ZY, Wang ZH, et al. The development of biosensor with imaging ellipsometry[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2004,3(3):1975-1978.

[3] 陳涉，靳剛．無標記橢偏成像蛋白質(zhì)芯片生物傳感器[J]．世界醫(yī)療器械,2009，15(9)：22-26．

[4] Chen YY，Wang ZH，Meng YH，et al．Biosensor with total internal reflection imaging ellipsometry[J]．Int J Nanoteehnol，2007，4(1-2)：171-178．

[5] Arwin H，Poksinski M，Johansen K．Total internal refleetion ellipsometry：pfinciples and applications[J]．Appl Opt，2004，43(15)：3028-3036．

[6] Wang ZH, Jin G. Covalent immobilization of proteins for the biosensor based on imaging ellipsometry[J]. J Immunolo Methods, 2004,285(2):237-243.

[7] 孟艷麗，王戰(zhàn)會，靳剛.A蛋白定向固定抗體用于橢偏光學(xué)生物傳感器免疫檢測[J].生物工程學(xué)報，2004，20(1)：111-114.

[8] Wang ZH, Jin G. Feasibility of protein A for the oriented immobilization of immunoglobulin on silicon surface for a biosensor with imaging ellipsometry .J Biochem Biophys Methods, 2003,57(3):203-211.

[9] Nielsen K, Smith P, Yu W, et al. Enzyme immunoassay for the diagnosis of brucellosis: chimeric Protein A-Protein G as a common enzyme labeled detection reagentfor sera for different animalspecies[J]. Veter Microbiol, 2004,101:123-129.

[10] Sakurabayashi I, Saito Y, Kita T, et al. Reference intervals for serum apolipoproteins A-Ⅰ, A-Ⅱ, B, C-Ⅱ,C-Ⅲ, and E in healthy Japanese determined with a commercial immunoturbidimetricassay and effects of sex, age, smoking, drinking, and Lp(a) level[J]. Clinica Chimica Acta, 2001,312(2):87-95.

Optimization of ellipsometry protein-chip technique in quantitative detection of serum apolipoprotein B

NINGXiang1,WANGJiaojiao,WANGJuan,BIShaojie,SHENGLin

(1TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China)

Objective To optimize the conditions for quantitatively detecting human serum apolipoprotein B via ellipsometry protein-chip technique and to evaluate the accuracy of this technique under optimum conditions.Methods In our study, we detected the gray values of solutions containing 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL anti-ApoB and 200 μg/mL ApoB with ellipsometry protein-chip technique, and the optimum concentration was the one with the highest gray value. We detected the gray values of solutions containing 0.3 mg/mL anti-ApoB and 5, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL ApoB before and after protein G was added in those solutions until its final concentration was 0.1 mg/mL. By comparing the grey values, we determined whether protein G should be added or not. We detected the grey values of solutions containing 0, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μg/mL ApoB via ellipsometry protein-chip technique under optimum conditions and calculated the difference between them and the gray values of the solutions without ApoB (consisted of anti-ApoB and protein G). Then we analyzed the correlations between the concentrations and the differences by drawing the curve and establishing the equation of it with concentration as X-axis and gray value as Y-axis. At last, we detected the gray values of 16 serum samples diluted 40 times twice through ellipsometry protein-chip technique and immunoturbidimetry under the optimum conditions. Then we calculated the concentrations of ApoB in the samples with the equation and compared them with its practical concentration. Results The optimum concentration of anti-ApoB was 0.3 mg/mL. The gray values in protein G group were higher than that of the contrast group (allP<0.05).The regression equation was y=-23.116Ln(1-x/60),R2=0.936 4 by Maple 9.5 software according to the curve. No significantly statistical difference was found between the ApoB concentrations detected via ellipsometry protein-chip technique and 16 cases of serum apoB concernttations (allP>0.05).Conclusions The optimal conditions for detection of ApoB in serum under ellipsometry protein-chip technique are anti-ApoB with the concentration of 0.3 mg/mL and protein G with the concentration of 0.1 mg/mL. The accuracy of the technique under such conditions is reliable.

ellipsometry protein-chip technique; optical protein-chip; ellipsometry imaging; ApoB; Protein G; Quantitative detection

國家自然科學(xué)基金資助項目(81500232)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0155)；山東省自然科學(xué)基金-聯(lián)合專項

資助項目(2014ZRE27456)。

寧翔(1986-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，醫(yī)師主要研究方向為動脈粥樣硬化的診治。E-mail: iningxiang@qq.com

簡介：王娟(1980-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為動脈粥樣硬化的診治。E-mail: moonlikewang@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.005

R446.11

A

1002-266X(2016)47-0017-04

2016-02-11)